Diterima 3 Februari 1998/Disetujui 27 Februari 1998 Bioteknologi saat ini bukan hanya terbatas pad a suatu kata saja, tetapi telah menjadi salah satu simbol perkem-bangan mutakhir dari ilmu pengetahuan dan teknologi. Pe-nerimaan terhadap bioteknologi juga bersifat mendunia. Tidak diragukan lagi bahwa negara-negara di dunia telah menyandilfkan banyak harapan dari bioteknologi. Perkem-bangan yang pesat dapat dilihat dari tumbuhnya berbagai perusahaan kecil sampai raksasa yang berdasarkan biotek-nologi sejalan dengan pembentukan komite-komite biotek-nologi dalam berbagai sistem pemerintahan. Selain itu juga dapat diamati penyebaran dan pengenalan mata kuliah bio-teknologi di berbagai universitas. Pemerintah dari negara-negara maju maupun yang sedang berkembang telah mengalokasikan sejumlah dana untuk mempercepat perkembangan bioteknologi di negara-nya, meskipun ada perbedaan dalam hal jumlah dana dan efisiensi pemakaiannya. Pada umumnya mereka mengha-rapkan agar kesejahteraan masyarakat dapat dipercepat dan ditingkatkan dengan bantuan bioteknologi. Banyak aspek bioteknologi yang telah membuahkan hasil berupa produk yang mempunyai nilai komersial tinggi. Dalam bidang kedokteran, bioteknologi akan mem-bawa cara-cara bam untuk diagnosis, pengobatan, dan pen-cegahan penyakit. Dalam bidang pertanian, setiap aspeknya mulai dari penempatan benih di dalam tanah sampai ma-kanan siap di meja makan akan terpengaruh oleh teknologi ini. Selain itu, bioteknologi juga menjadi sandaran untuk penyelamat lingkungan karena menawarkan berbagai alter-natifuntuk membersihkan Iingkungan dari pencemaran yang sulit dibersihkan dengan cara-cara lain. Meskipun banyak dari kita yakin bahwa bioteknologi itu penting, tetapi kebanyakan dari kita tidak mengetahui dengan tepat apa yang dimaksud dengan bioteknologi. Hal yang membingungkan terse but dapat dimengerti kar-ena is-tilah bioteknologi sering kali didefinisikan berbeda oleh orang yang berbeda. Apakah bioteknologi itu sebenarnya? DEFINISI BIOTEKNOLOGI Istilah bioteknologi pertama kali dikemukakan oleh Karl Ereky, seorang insinyur hongaria, pada tahun 1917 untuk mendeskripsikan produksi babi dalam skala besar de-ngan menggunakan bit gula sebagai sumber pakannya. Sampai tahun 1970-an bioteknologi selalu berasosiasi dengan rekayasa biokimia biochemical engineering dan pada umumnya kuliah-kuliah yang berhubungan dengan bio-teknologi juga diberikan oleh Jurusan Rekayasa Kimia atau Rekayasa Biokimia. Sesungguhnya mendefinisikan bioteknologi sangat gam pang. Pecahlah kata tersebut berdasarkan akar katanya "bio" dan "teknologi", maka akan diperoleh definisi sebagai berikut Penggunaan organisme atau sistem hidup untuk me-mecahkan suatu masalah atau untuk menghasilkan produk yang berguna. Dengan definisi tersebut dapat dipahami bahwa bio-teknologi bukanlah sesuatu yang bam. Kita telah mendo-mestikasi tanaman dan hewan sekitar 10 000 tahun yang lalu. Selama beribu-ribu tahun kita telah menggunakan mik-rob seperti khamir dan bakteri untuk membuat produk-produk berguna seperti roti, anggur, keju, yogurt, tempe, dan nata de coco. Hampir semua antibiotik berasal dari mikrob, demikian juga enzim-enzim yang dipakai untuk ber-bagai keperluan mulai dari pembuatan sirup fruktosa sampai pencucian pakaian. Dalam bidang pertanian, kita telah menggunakan mikrob sejak abad 19 untuk penyuburan tanah melalui bakteri-bakteri penambat N r Mikrob juga telah digunakan secara ekstensif untuk pembersihan Iimbah dan kotoran selama berpuluh-puluh tahun. Dalam bidang medis, vaksin-vaksin tertentu dibuat dari virus atau bakteri tertentu yang telah dilemahkan. lika demikian, mengapa sering dikatakan bahwa bio-teknologi adalah suatu terobosan teknologi yang revo-lusioner, padahal teknologi ini mungkin sudah ada sejak adanya peradaban manusia. Berikut ini adalah jawabannya. Selama periode 1960-an sampai 1970-an, pengetahuan kita tentang biologi sel dan molekuler telah sampai pada suatu titik yang memungkinkan kita untuk memanipulasi suatu organisme di taraf seluler atau molekuler. Memanipulasi suatu organisme untuk kepentingan kita bukanlah suatu hal yang barn. Yang baru yaitu bagaimana kita melakukan ma-nipulasi tersebut. Figures - uploaded by Antonius SuwantoAuthor contentAll figure content in this area was uploaded by Antonius SuwantoContent may be subject to copyright. Discover the world's research25+ million members160+ million publication billion citationsJoin for free Hoyati. Maret 1998, him. 25-28 ISSN 0854-8587 Vol. 5. ULASAN Bioteknologi Molekuler Mengoptimalkan Manfaat Keanekaan Hayati Melalui Teknologi DNA Rekombinan ANTONIUS SUWANTO Jurusan Biologi FMIPA IPB, Jalan Raya Pajajaran, Bogor 16144, dan Southeast Asian Regional Center for Tropical Biology, Kotak Pos 116, Bogor 16001 TeL 62-251-625965, Fax. 62-251-621724, E-mail asuwanto Diterima 3 Februari 1998/Disetujui 27 Februari 1998 Bioteknologi saat ini bukan hanya terbatas pad a suatu kata saja, tetapi telah menjadi salah satu simbol perkem-bangan mutakhir dari ilmu pengetahuan dan teknologi. Pe-nerimaan terhadap bioteknologi juga bersifat mendunia. Tidak diragukan lagi bahwa negara-negara di dunia telah menyandilfkan banyak harapan dari bioteknologi. Perkem-bangan yang pesat dapat dilihat dari tumbuhnya berbagai perusahaan kecil sampai raksasa yang berdasarkan biotek-nologi sejalan dengan pembentukan komite-komite biotek-nologi dalam berbagai sistem pemerintahan. Selain itu juga dapat diamati penyebaran dan pengenalan mata kuliah bio-teknologi di berbagai universitas. Pemerintah dari negara-negara maju maupun yang sedang berkembang telah mengalokasikan sejumlah dana untuk mempercepat perkembangan bioteknologi di negara-nya, meskipun ada perbedaan dalam hal jumlah dana dan efisiensi pemakaiannya. Pada umumnya mereka mengha-rapkan agar kesejahteraan masyarakat dapat dipercepat dan ditingkatkan dengan bantuan bioteknologi. Banyak aspek bioteknologi yang telah membuahkan hasil berupa produk yang mempunyai nilai komersial tinggi. Dalam bidang kedokteran, bioteknologi akan mem-bawa cara-cara bam untuk diagnosis, pengobatan, dan pen-cegahan penyakit. Dalam bidang pertanian, setiap aspeknya mulai dari penempatan benih di dalam tanah sampai ma-kanan siap di meja makan akan terpengaruh oleh teknologi ini. Selain itu, bioteknologi juga menjadi sandaran untuk penyelamat lingkungan karena menawarkan berbagai alter-natifuntuk membersihkan Iingkungan dari pencemaran yang sulit dibersihkan dengan cara-cara lain. Meskipun banyak dari kita yakin bahwa bioteknologi itu penting, tetapi kebanyakan dari kita tidak mengetahui dengan tepat apa yang dimaksud dengan bioteknologi. Hal yang membingungkan terse but dapat dimengerti kar-ena is-tilah bioteknologi sering kali didefinisikan berbeda oleh orang yang berbeda. Apakah bioteknologi itu sebenarnya? DEFINISI BIOTEKNOLOGI Istilah bioteknologi pertama kali dikemukakan oleh Karl Ereky, seorang insinyur hongaria, pada tahun 1917 untuk mendeskripsikan produksi babi dalam skala besar de-ngan menggunakan bit gula sebagai sumber pakannya. Sampai tahun 1970-an bioteknologi selalu berasosiasi dengan rekayasa biokimia biochemical engineering dan pada umumnya kuliah-kuliah yang berhubungan dengan bio-teknologi juga diberikan oleh Jurusan Rekayasa Kimia atau Rekayasa Biokimia. Sesungguhnya mendefinisikan bioteknologi sangat gam pang. Pecahlah kata tersebut berdasarkan akar katanya "bio" dan "teknologi", maka akan diperoleh definisi sebagai berikut Penggunaan organisme atau sistem hidup untuk me-mecahkan suatu masalah atau untuk menghasilkan produk yang berguna. Dengan definisi tersebut dapat dipahami bahwa bio-teknologi bukanlah sesuatu yang bam. Kita telah mendo-mestikasi tanaman dan hewan sekitar 10 000 tahun yang lalu. Selama beribu-ribu tahun kita telah menggunakan mik-rob seperti khamir dan bakteri untuk membuat produk-produk berguna seperti roti, anggur, keju, yogurt, tempe, dan nata de coco. Hampir semua antibiotik berasal dari mikrob, demikian juga enzim-enzim yang dipakai untuk ber-bagai keperluan mulai dari pembuatan sirup fruktosa sampai pencucian pakaian. Dalam bidang pertanian, kita telah menggunakan mikrob sejak abad 19 untuk penyuburan tanah melalui bakteri-bakteri penambat Nr Mikrob juga telah digunakan secara ekstensif untuk pembersihan Iimbah dan kotoran selama berpuluh-puluh tahun. Dalam bidang medis, vaksin-vaksin tertentu dibuat dari virus atau bakteri tertentu yang telah dilemahkan. lika demikian, mengapa sering dikatakan bahwa bio-teknologi adalah suatu terobosan teknologi yang revo-lusioner, padahal teknologi ini mungkin sudah ada sejak adanya peradaban manusia. Berikut ini adalah jawabannya. Selama periode 1960-an sampai 1970-an, pengetahuan kita tentang biologi sel dan molekuler telah sampai pada suatu titik yang memungkinkan kita untuk memanipulasi suatu organisme di taraf seluler atau molekuler. Memanipulasi suatu organisme untuk kepentingan kita bukanlah suatu hal yang barn. Yang baru yaitu bagaimana kita melakukan ma-nipulasi tersebut. 26 ULASAN Sebelumnya, kita menggunakan suatu organisme utuh untuk seleksi bahan genetika unggul, tetapi sekarang kita menggunakan sel-sel dan molekul organisme tersebut. Sebelurnnya kita melakukan manipulasi tanpa mengetahui mekanisme yang mendasari manipulasi tersebut sehingga sulit diprediksi hasilnya, tetapi sekarang kita mengerti manipulasi yang kita lakukan pada taraf yang paling mendasar yaitu taraf molekuler. Oleh karena itu, kita dapat memprediksi pengaruh manipulasi yang dilakukan dan mengarahkan perubahan yang diinginkan dengan tingkat ketepatan yangjauh lebih tinggi. Selama sekitar 45 tahun sejak Karl Ereky memper-kenalkan istilah bioteknologi, istilah ini telah dipakai de-ngan pengertian berbeda oleh pakar yang berbeda sehingga menimbulkan kerancuan. Kerancuan ini berakhir pada 1961 ketika Carl Goren Heden merekomendasikan agar nama suatu jumal saintifik untuk mempublikasi penelitian dalam bidang mikrobiologi terapan dan fennentasi diubah dari Journal oj Microbiological and Biochemical Engineering and Technology menjadi Biotechnology and Bioengi-neering. Sejak saat itu, bioteknoloogi diartikan sebagai "produksi barang dan jasa menggunakan organisme, sistem, atau proses biologi". Oleh karena itu penelitian bioteknologi sangat bergantung pada mikrobiologi, biokimia, dan reka-yasakimia. Suatu proses fndustri bioteknologi yang menggunakan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk, pada dasamya terdiri atas tiga tahapan utama Gambar I yang secara umum dapat dideskripsikan sebagai berikut I. Proses hulu Serangkaian perlakuan dilibatkan pada bahan mentah sehingga dapat digunakan sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme sasaran. 2. Fennentasi dan transfonnasi Penumbuhan mikroor-ganisme sasaran dalam bioreaktor besar biasanya lebih dari 100 liter yang diikuti dengan produksi hasil biotransfonnasi bahan yang diinginkan, misalnya antibiotik, asam amino, enzim, atau asam-asam organik. 3. Proses hilir Pemumian senyawa atau bahan yang di-inginkan dari medium fennentasi atau dari massa sel. Penelitian-penelitian bioteknologi dimaksudkan untuk memaksimalkan efisiensi tiap tahap dalam proses biotek-nologi serta dapat menemukan mikroorganisme yang sesuai untuk produksi pangan, pakan, suplemen pangan, dan obat-obatan. Selama tahun 1960-an sampai 1970-an, penelitian-penelitian ini difokuskan pada proses hulu, desain bioreak-tor, dan proses hilir. Oleh karena itu banyak dihasilkan in-fonnasi yang menjadi dasar penting bagi pembuatan bio-reaktor serta instrumentasinya, serta teknologi scale-up yang lebih efisien dalam menghasilkan berbagai produk. Dari keseluruhan prosesindustri bioteknologi, bagian biotransfonnasi merupakan komponen yang paling sulit dioptimalkan secara sistematis. Pad a umurnnya, galur-galur mikrob yang diisolasi dari alam tidak optimal untuk dipakai langsung dalam industri bioteknologi. Oleh karena itu in-Hayati duksi mutasi melalui mutagenesis kimia atau radiasi ultra-violet digunakan untuk mengubah secara acak sus un an ge-netika suatu galur mikrob dengan harapan dapat diperoleh galur yang profilnya lebih optimal. Dalam beberapa hal misalnya dalam produksi antibiotik. cara-cara mutasi acak dan seleksi telah berhasil dilakukan. Meskipun demikian pada sebagian industri bioteknologi lainnya. mutasi acak malah menurunkan produksi atau hasilnya sulit sekali di-prediksi karena adanya mutasi pada bagian-bagian lain dari genom mikrob yang bersangkutan. Selain itu, derajat per-baikan galur masih sangat dibatasi oleh sistem biologi yang ada. Contohnya dalam produksi asam sitrat digunakan Aspergillus niger yang mampu memproduksi asam sitrat dengan rendemen tinggi. Tetapi untuk fennentasi media pa-dat, spora kapang ini dapat menimbulkan masalah medis yang relatif sulit penanganannya di lapangan. Sementara itu mutasi acak untuk meniadakan spora dari Aspergillus niger tanpa menurunkan rendemen asamnya sangat sulit sekali dilakukan tanpa melewati batas-batas biologi Aspergillus niger. Perbaikan genetika secara tradisional mutasi acak sangat memakan waktu. tidak dapat diprediksi hasilnya, dan menjadi mahal karena banyaknya galur atau mutan yang harus diseleksi, ditapis. dan selanjutnya diuji kemam-puannya untuk keperJuan tertentu. Meskipun demikian, sam-pai sekitar akhir 1970-an bioteknologi telah menjadi suatu disiplin tersendiri yang sudah mapan dengan prosedur-prosedur khas untuk mengembangkan berbagai produk ko-mersial. Perkembangan bioteknologi berubah drastis sejak di-temukannya teknologi DNA rekombinan. Perubahan ini sa-ngat nyata terutama dalam hal teknologi proses hulu. dan seleksi galur. Dengan teknologi DNA rekombinan kita tidak saja mampu melakukan perbaikan galur dengan tepat dan dapat diprediksi. tetapi juga dapat merancang bangun galur baru dengan bahan genetika tambahan yang tidak pemah ada pada galur asalnya. Dalam kasus produksi asam sitrat, misalnya kita dapat memindahkan gen-gen kunci untuk bio-sintesis asam sitrat dari Aspergillus niger ke dalam kapang lain atau bakteri sehingga lebih memudahkan penanganan pada proses hilirnya atau menghindari masalah adanya spora. Dengan adanya teknologi DNA rekombinan, maka optimasi biotransformasi dalam suatu proses bioteknologi dapat diperoleh dengan lebih terarah dan langsung. Tekno-logi DNA rekombinan atau rekayasa genetika memung-kinkan kita merancang bangun, bukan hanya mengisolasi suatu galur yang sangat produktif. Sel prokariot atau eukariot dapat digunakan sebagai "pabrik biologi" untuk memproduksi insulin, interferon, honnon pertumbuhan, bahan anti virus, dan berbagai macam protein lainnya. Tek-nologi DNA rekombinan juga memungkinkan produksi senyawa-senyawa tertentu yang jumlahnya secara alami sangat sedikit sehingga tidak ekonomis bila diekstrak Bahan mentah Proses Fennentasi & Proses Produk ~ akhir ~ hulu ~ biotransfonnasi ~ hilir Gambar I. Tahap-tahap dalam proses industri melalui bioteknologi. fol. 5,1998 angsung dari sumber alaminya. Sebagai contoh, indigo - zat varna biru yang dipakai untuk mewarnai blue jeans - telah Iiproduksi oleh Escherichia coli rekombinan sehingga da-,at diperoleh indigo yang relatif lebih ekonomis, selalu ter-,edia, dan dengan teknologi yang lebih ramah Iingkungan. rumbuhan dan hewan juga dapat digunakan sebagai bio-eaktor untuk menghasilkan produk baru atau produk hasil nodifikasi yang tidak mungkin diperoleh dengan seleksi nutagenesis atau persilangan biasa. Akhimya, teknologi ini nemungkinkan kita untuk menangani penyakit-penyakit ;enetika melalui terapi gen, masalah pengobatan berbagai enis kanker, dan penyediaan vaksin DNA sebagai altematif Illksin masa depan. Penggabungan antara teknologi DNA rekombinan lengan bioteknologi melahirkan suatu bidang studi yang angat dinamis dan kompetitif yang disebut Bioteknologi l,Iolekuler. Bidang studi yang relatif baru ini, seperti halnya .erkembangan awal biologi molekuler di tahun I 960-an. lipenuhi oleh berbagai harapan yang kadang-kadang me-ampaui kemampuan para pakar pada saat itu untuk meng-1llSilkan suatu produk. Oleh karena itu dalam mencermati .erkembangan bioteknologi molekuler kita sebaiknya dapat nelihat sisi harapan, kenyataan, atau fantasi dari bidang ;tudi yang sedang berkembang pesat ini. Karena bioteknologi molekuler berubah sangat pesat, naka suatu strategi penelitian yang saat ini sangat relevan Ian menjanjikan dapat berbalik menjadi strategi yang tidak konomis, tidak efisien, atau sulit sekali implementasinya. iementara itu cara-cara atau pendekatan lain mulai marak libicarakan atau dilakukan sebagai strategi altematif. Oleh wena itu, industri bioteknologi modem harus dapat me-nantau perkembangan disiplin ilmu terkait sehingga selalu lapat mengoptimalkan proses-proses industrinya. Dengan lemikian, tampaknya tidak terlalu berlebihan bila dikatakan >ahwa industri bioteknologi molekuler adalah industri yang erbasis riset research-based industry. Di masa de pan, ale dapat dielakkan lagi bahwa bioteknologi molekuler akan nenjadi metode baku untuk mengembangkan suatu sistem lidup dengan fungsi atau kemampuan baru dalam mempro-luksi suatu barang ataujasa. Oleh karena itu, perkembangan ndustri bioteknologi akan selalubergantung pada penelitian lasar yang serius dan tepat sasaran. Sebagian besar disiplin sains tidak berdiri sendiri. isiplin sains pada umumnya merupakan peleburan penge-ahuan dari berbagai riset yang berbeda. Untuk bioteknologi nolekuler, komponen bioteknologi dikembangkan dan di-;empumakan oleh pakar-pakar mikrobiologi industri dan ~ekayasa kimia, sedangkan pengembangan komponen tek-lologi DNA rekombinan sangat bergantung pada penemu-Ul-penemuan dalam biologi molekuler, genetika, biokimia, ian mikrobiologi. Sebagian besar pengetahuan yang men-iasari bioteknologi dihasilkan oleh penelitian-penelitan da-lar di universitas Tabel 1. Jadi, bioteknologi molekuler laIlgat bergantung pada perkembangan berbagai penge-ahuan dasar dalam usahanya untuk menghasilkan produk-~roduk komersial yang kompetitif. ULASAN 27 Tabe1 I. Perkembangan sejarah bioteknologi molekuler. Tahun Peristiwa 1917 Ereky memperkenalkan istilah bioteknologl 1943 Pen,isilin diproduksi dalam skala industri 1944 Avery, Macleod, McCarty mendemonstrasikan bahwa DNA adalah bahan genetika 1953 Watson dan Crick menentukan struktur DNA 1961 Jurnal Biotechnology and Bioengineering ditetapkan 1961-1966 Seluruh sandi genetika terungkapkan 1970 Enzim restriksi endonuklease pertama kali diisolasi 1972 Khorana dan kawan-kawan berhasil mensintesis secara kimiawi seluruh gen tRNA 1973 Boyer dan Cohen memaparkan teknologi DNA rekom-binan 1975 Kohler dan Milstein menjabarkan produksi antibodi monoklonal 1976 Perkembangan teknik-teknik untuk menentukan sekuen DNA 1978 Genentech menghasilkan insulin manusia dalam E. coli 1980 Mikroorganisme hasil manipulasi genetika dapat dipa-tenkan Kasus Diamond vs Chakrabarty di Amerika Serikat 1981 Untuk pertama kalinya automated DNA synthesizers dijual secara komersial 1981 Untuk pertama kalinya kit diagnostik berdasar antibodi disetujui untuk dipakai di Amerika Serikat 1982 Untuk pertama kalinya vaksin hewan hasil teknologi DNA rekombinan disetujui pemakaiannya di Eropa 1983 Plasmid Ti hasil rekayasa genetika dipakai untuk transformasi tanaman 1988 US patent diberikan untuk meneit rentan kanker hasil rekayasa genetika, 1988 Metode Polymerase Chain Reaction dipublikasi 1990 Percobaan terapi gen sel somatik pada manusia disetujui Arnerika Serikat REKA Y ASA GENETIKA DAN KERAGAMAN HAYATI Rekayasa genetika yang sering kali sinonim dengan teknologi DNA rekombinan merupakan tulang punggung dan pemicu lahimya bioteknologi molekuler. DNA rekom-binan dikonstruksi dengan menggabungkan materi genetika dari dua atau lebih sumber yang berbeda atau melakukan perubahan secara terarah pada suatu materi genetika terten-tu. Di alam, materi genetika melakukan rekombinasi secara konstan. Berikut ini adalah beberapa contoh rekombinasi genetika dari dua sumber atau lebih i Rekombinasi yang terjadi saat proses meiosis dalam pembentukan garnet tanpa atau dengan terjadinya pindah silang, ii Saat sperma dan ovum melebur pada proses fertilisasi, dan iii Saat sel prokariot melakukan transaksi bahan genetika melalui kon-jugasi, transformasi, atau transduksi. 28 ULASAN Dalam tiap contoh rekombinasi tersebut dapat di-mengerti bahwa rekombinasi merupakan salah satu cara untuk meningkatkan terjadinya keragaman hayati di alamo Materi genetika yang ada di alam menyajikan suatu bahan mentah evolusi yang dilakukan oleh seleksi alam atau se-leksi buatan yang dilakukan oleh manusia. A. Penggunaan Variasi Genetika dalam Pemuliaan Segera setelah manusia mampu mendomestikasi or-ganisme, maka mulailah terjadi pemuliaan secara selektif untuk mengubah bahan genetikanya sesuai dengan ke-inginan. Suatu individu tertentu dalam populasi, yang ber-arti suatu materi genetika tertentu, disukai oleh manusia dan dipakai sebagai induk untuk generasi-generasi organisme berikutnya. Dengan menyeleksi suatu variasi genetika ter-tentu dari suatu populasi dan menyingkirkan variasi gene-tika lainnya, maka kita sudah melakukan rekombinasi bahan genetika dengan terarah dan dengan tujuan khusus. Aki-batnya, kita secara radikal mengubah bahan genetika orga-nisme yang telah kita domestikasikan. Dengan demikian, variasi genetika telah menjadi sum-ber alami bagi manusia untuk melakukan eksploitasi selama berabad-abad. Pengetahuan kita untuk melakukan pe-muliaan secara selektif dan yang hasilnya makin dapat di-prediksi telah berkembang pesat. Rekayasa genetika me-rupakan langkah berikutnya dalam kesinambungan us~ha manusia untuk mencari varietas atau galur yang pahng sesuai. B. Variasi Genetika Melalui Rekayasa Genetika Istilah teknologi DNA rekombinan atau rekayasa ge-netika secara ringkas dapat diartikan sebagai teknik mole-kuler yang dengan tepat mampu mengubah suatu molekul DNA, atau menggabungkan molekul DNA tertentu dari sumber-sumber yang berbeda. Rekombinasi DNA dilakukan dengan enzim enzim restriksi dan ligase yang dapat mela-kukan pemotongan dan penyambungan molekul DNA de-ngan tepat dan dapat diprediksi. DNA rekombinan selan-jutnya dimasukkan ke dalam organisme sasaran melalui in-troduksi langsung transformasi, melalui virus, atau bakteri. Oleh karena itu, dalam melakukan rekombinasi gene-tika, seorang pemulia selain dapat melakukannya m~lalui penggabungan sel telur dan sperma atau serbuk sarI dan putik pada tanaman pada metode pemuliaan selektif, dia dapat pula melakukan rekombinasi bahan genetika ketelitian yang lebih tinggi dengan melakukannya dl taraf molekuler. C. Pemuliaan Selektifvs Rekayasa. Genetika Banyak pakar memandang rekayasa genetika secara sederhana sebagai kelanjutan dari teknik pemuliaan selektif karena kedua teknik itu pada dasarnya bertujuan untuk menggabungkan materi gen~tika dari sumber. ~a~g .berb~da untuk menghasilkan organlsme yang memlhkl slfat-slfat Hayati baru yang berguna. Meskipun pada dasamya rekayasa gene. tika dan pemuliaan selektif memiliki kesamaan, namun kedua teknik itu juga memiliki perbedaan-perbedaan pen. ting Tabel 2. Tabel 2. Perbedaan antara pemuliaan selektif dan rekayasa genetika. Parameter Pemuliaan selektif Rekayasa genetika Tingkat Organisme utuh Sel atau molekul Ketepatan Sekumpulan gen Satu gen lunggal Kepaslian Perubahan genelika Perubahan bahan gene-sulil atau lidak mung-lika dapal dikarakleri-kin dikaraklerisasi sasi dengan baik Balasan laksonomi Hanya dapat dipakai Tidak ada balasan dalam salU spesies atau laksonoml salu genus Dalam rekayasa genetika, kita memindahkan satu gen tunggal yang fungsinya sudah diketahui dengan jelas, se-dangkan pada umumnya yang dipindahkan berupa kum-pulan gen, meskipun dalam metode pemuliaa~ tanaman ada metode silang balik back cross yang tuJuannya men-transfer satu gen sehingga diperoleh galur isogenik. Dengan meningkatkan ketepatan dan kepastian dalam manipulasi ge-netika, maka resiko untuk menghasilkan organisme dengan sifat-sifat yang tidak diharapkan dapat diminimurnkan. Model uji coba trial-and-error dalam pemuliaan selektif dapat dibuat menjadi lebih tepat ~elalui reka~asa genetik~. Dalam pemuliaan selektif klta mengawmkan orgams-me dari satu spesies. dari spesies yang berbeda, atau ka-dang-kadang dari genus yang berbeda. Dalam ~ genetika sudah tidak ada lagi hambatan taksonoml. Man~î‚pulasi genetika tidak lagi terbatas I?ada sekelompok k~cIl variasi genetika. Bila kita inginkan suatu bahan. genetik~ untuk disisipkan pada suatu organisme, maka tldak lagl menjadi masalah seberapa jauh hubungan keke~abatan orga-nisme pemilik bahan genetika tersebut. Sebagal contoh, gen penyandi antibodi dari manusia dapat dipindahkan k~ ta naman tembakau sehingga kita dapat memanen antlbo~1 bukan dari hewan percobaan, yang sering kali kurang dl sukai oleh kelompok pencinta binatang, tetapi langsung d~ ekstrak daun tembakau. Kemampuan memindahkan gen dar~ satu organisme ke organisme lain tanpa batasan taksonoml memungkinkan kita memanfaatkan sumber daya alam y~g luar biasa, yaitu keragaman hayati biodiversity. Tentu saJa semua usaha itu dapat dilakukan dengan dampak yang minimal bila kita mau belajar dari kearifan proses-proses biologi yang mendasari keragaman tersebut. DAFT AR PUST AKA Glick, & Pasternak. 1994. Molecular 8io-technology PrinCiples and Applications of Recom-binant DNA. Washington, ASM Press. Russo, E. & D. Cove. 1995. Genetic Engineering Dream.~ and Nightmares. New York Freeman. ... Melalui teknologi DNA rekombinan kita tidak hanya dapat memperbaiki sifat suatu galur dengan tepat, tetapi juga dapat merancang galur baru yang di dalamnya terdapat materi genetik tambahan yang sebelumnya tidak ada pada galur asalnya. Selain itu, melalui teknologi DNA rekombinan sel prokariot atau eukariot dapat dimanfaatkan sebagai pabrik biologi untuk memproduksi insulin, hormon pertumbuhan, bahan anti-virus, dan bermacam protein lainnya, serta memungkinkan untuk memproduksi senyawa-senyawa tertentu yang sangat sedikit jumlahnya jika diekstrak langsung secara alami Suwanto, 1998. ...Bioteknologi lahir dari perkembangan teknologi dan ilmu pengetahuan di bidang matematika, biologi, fisika, dan kimia. Dalam keseharian kita sudah melakukan praktik bioteknologi di tingkat sederhana seperti fermentasi pada olahan pangan pembuatan tempe hingga rekayasa genetik yang menggunakan Polimerase Chains Reaction PCR dalam pengaplikasiannya. Bioteknologi dibahas secara sederhana dalam buku ini. Hal itu bertujuan agar buku ini mudah dipahami. Buku ini berisi dari 9 sembilan bab yang menunjang informasi tetang bioteknologi. Bab 1 Pengenalan Bioteknologi Bab 2 Struktur Gen Prokariot dan Eukariot Bab 3 Polymerase Chain Reaction Bab 4 Teknologi DNA Rekombinan dan Transgenik Bab 5 Teknologi Fermentasi, Manfaat dan Aplikasinya Bab 6 Enzim Dan Peranannya Dalam Bioteknologi Bab 7 Produksi Massal Enzim Untuk Komersial Bab 8 Bioteknologi Tanaman, Manfaat dan Aplikasinya Bab 9 Rekayasa Genetika Teknologi DNA-rekombinan dan Aplikasinya Khairunnisa LubisRevolusi hijau green revolution yang dikumandangkan 1960 yang ditandai dengan perbaikan bercocok tanam seperti penggunaan bibit unggul, Oleh KHAIRUNNISA LUBIS pemuliaan tanaman-khairunnisa3ResearchGate has not been able to resolve any references for this publication.
TeknologiDNA Rekombinan 1.26 Latihan 1.46 Rangkuman 1.47 Tes Formatif 2 1.48 peneliti, seperti Hugo de Vries, Erich Von Tschermak, dan Carl Correns. terpisah melakukan penelitian pewarisan sifat. 1902 Walter Stanborough Sutton memberi nama pada agen pewarisan sifat Mendel sebagai "gen". 1903 Walter Sutton dan Theodor Boveri, yang
Terjemahan Bab 3 Buku Introduction to Biotechnology Thieman dan Palladino Third Edition Discover the world's research25+ million members160+ million publication billion citationsJoin for free TERJEMAHANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN GENOMINTRODUCTION TO BIOTECHNOLOGY BY THIEMAN-PALLADINOTHIRD EDITION PEARSONUntuk Memenuhi Tugas Matakuliah Biologi ModernOlehDina Chamidah/190341964012Dosen PengampuProf. Dr. agr. Mohamad. Amin, STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI S3FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS NEGERI MALANG2020 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN GENOMSetelah menyelesaikan bab ini, Anda harus dapat Tentukan teknologi DNA rekombinan dan jelaskan bagaimana teknologi itu digunakanuntuk mengkloning gen dan memanipulasi DNA. Bandingkan dan kontraskan berbagai jenis vektor kloning; menggambarkan fitur danaplikasi praktis mereka. Diskusikan bagaimana perpustakaan DNA dibuat dan disaring untuk mengidentifikasi genyang dikloning yang diminati. Jelaskan bagaimana elektroforesis gel agarosa, reaksi berantai polimerase PCR,sekuensing DNA, dan teknik molekuler lainnya digunakan untuk mempelajari struktur,fungsi, dan ekspresi gen. Jelaskan bagaimana teknik sekuensing senapan genome dan sekuensing highthroughputkeseluruhan memungkinkan para ilmuwan untuk menganalisis genom dengan cepat. Memahami temuan utama dari Proyek Genom Manusia, aplikasi pengetahuan ilmiah danmedis potensial tentang genom manusia, dan masalah etika, hukum, dan sosial yang terkait. Jelaskan mengapa disiplin “omics” terkait genom berkembang pesat sebagai bidangpenelitian. Berikan contoh bagaimana bioinformatika dapat digunakan untuk menganalisis urutan danstruktur asam nukleat dan yang telah Anda pelajari, bioteknologi bukanlah ilmu baru. Namun, eramodern bioteknologi dimulai ketika teknik kloning DNA dikembangkan. Sejak tahun 1970-an dan berlanjut hingga hari ini, metode laboratorium yang luar biasa dan berkembang pesatdalam teknologi DNA rekombinan dan rekayasa genetika telah mengubah biologi molekuler,ilmu dasar, dan penelitian medis selamanya. Dalam bab ini, kami menyajikan ikhtisarteknologi DNA rekombinan. Kami kemudian melihat berbagai teknik menakjubkan yangdigunakan para ilmuwan untuk mengkloning gen dan mempelajari struktur dan fungsi gen. Bab ini diakhiri dengan pengantar genomik dan bioinformatika, yang menyediakan metodeuntuk mempelajari MASA DEPANAda banyak arah potensial yang menarik di masa depan dalam penelitian DNA dangenom rekombinan. Tanpa keraguan satu bidang kemajuan substansial adalah penyelesaianribuan proyek genom untuk berbagai tanaman, hewan, bakteri, virus, dan organisme ilmuwan terus mencari genom dari organisme di seluruh dunia untuk mencari gen barudengan aplikasi potensial dalam bioteknologi. Menyusul keberhasilan Proyek GenomManusia, penggunaan informasi genom untuk aplikasi baru termasuk metode baru untukdeteksi dini gen penyakit dan strategi pengobatan berbasis gen baru untuk penyakit sepertikanker dan banyak kondisi kesehatan manusia lainnya sangat luar biasa menjanjikan untukmengurangi rasa sakit dan penderitaan melalui bioteknologi. Dan di dekat cakrawala adalahsekuensing genomik pribadi dari genom Memperkenalkan Teknologi DNA Rekombinan dan Kloning DNAKetika ilmuwan James Watson dan Francis Crick menemukan bahwa struktur DNAmerupakan molekul dobel helix, mereka menunjukkan potensi dan pengaruh daripenemuannya. Namun, bahkan para pemenang Hadiah Nobel ini pun tidak dapatmembayangkan langkah menakjubkan di mana biologi molekuler akan maju selama setengahabad berikutnya. Pada tahun sebelum dan sesudah penemuan Watson dan Crick, banyakilmuwan yang berkontribusi pada pemahaman tentang DNA sebagai materi genetic dari selhidup. Beberapa ilmuwan mempelajari struktur dan replikasi DNA pada sering hanya disebut fag, adalah virus yang menginfeksi sel bakteri. Banyakyang kita ketahui tentang replikasi DNA dan enzim sintesis DNA telah dipelajari darimempelajari bakteri dan fag. Sebagai contoh, ingat bahwa DNA ligase bergabung bersama fragmen DNA yang berdekatan fragmen Okazaki selama replikasi DNA. Seperti yang akansegera Anda pelajari, DNA ligase adalah enzim penting dalam teknologi DNA akhir 1960-an, banyak ilmuwan tertarik pada kloning gen; mereka berspekulasibahwa dimungkinkan untuk mengkloning DNA dengan memotong dan menempelkan DNAdari berbagai sumber teknologi DNA rekombinan. Tampaknya istilah kloning gen,teknologi DNA rekombinan, dan rekayasa genetika menggambarkan proses yang DNA rekombinan umumnya digunakan untuk memungkinkan kloning gen,sedangkan rekayasa genetika sering mengandalkan teknologi DNA rekombinan dan kloninggen untuk memodifikasi genom suatu organisme. Namun, istilah teknologi DNA rekombinandan rekayasa genetika sering digunakan secara bergantian. Klon berasal dari kata Yunaniyang menggambarkan pemotongan ranting yang digunakan untuk menyebarkan ataumenyalin tanaman. Definisi biologis modern dari klon adalah molekul, sel, atau organismeyang dihasilkan dari entitas tunggal lainnya. Metode laboratorium yang diperlukan untukkloning gen seperti yang dijelaskan dalam bab ini berbeda dari teknik yang digunakan untukmengkloning seluruh Retriksi dan Vektor Plasmid DNAPada awal 1970-an, kloning gen menjadi kenyataan. Banyak penemuan hampirbersamaan dan upaya kolaboratif di antara beberapa peneliti mengarah pada penemuan duakomponen penting yang memungkinkan kloning gen dan teknik DNA rekombinan mungkinenzim restriksi dan plasmid DNA plasmid. Enzim restriksi adalah enzim pemotong DNA,dan DNA plasmid adalah bentuk melingkar dari DNA yang dapat bereplikasi sendiri yangdapat dimanipulasi oleh para ilmuwan untuk membawa dan mengkloning potongan-potonganDNA mikrobiologi pada 1960-an menemukan bahwa beberapa bakteri dilindungi darikehancuran oleh bakteriofag karena mereka dapat membatasi replikasi fag. Ilmuwan SwissWerner Arber mengusulkan bahwa pertumbuhan fag terbatas terjadi karena beberapa bakterimengandung enzim yang dapat memotong DNA virus menjadi potongan-potongan kecil,sehingga mencegah replikasi virus. Karena kemampuan ini, enzim ini disebut enzim restriksi. Pada tahun 1970, bekerja dengan bakteri Haemophilus influenzae, peneliti Johns HopkinsUniversity Hamilton Smith mengisolasi Hin dIII, enzim restriksi pertama yang dikarakterisasidengan baik dan digunakan untuk kloning DNA. Enzim restriksi juga disebut restriksiendonuklease endo, "di dalam"; nuklease, "Enzim pemecah asam nukleat" karena merekamemotong sekuens DNA yang bertentangan dengan enzim yang memotong dari ujungsekuens DNA exonucleases. Smith menunjukkan bahwa HindIII dapat digunakan untukmemotong atau mencerna DNA menjadi fragmen kecil. Pada 1978, Smith berbagi HadiahNobel dengan Werner Arber dan Daniel Nathans untuk penemuan mereka tentang enzimrestriksi dan aplikasi restriksi terutama ditemukan pada bakteri, dan mereka diberi nama yangdisingkat berdasarkan genus dan nama spesies bakteri dari mana mereka diisolasi. Sebagaicontoh, salah satu enzim restriksi pertama yang diisolasi, Eco RI, dinamakan demikian karenaditemukan dalam strain E. coli yang disebut RY13. Enzim restriksi memotong DNA denganmemotong ikatan fosfodiester dalam tulang punggung gula-fosfat yang bergabung dengannukleotida yang berdekatan dalam untai DNA. Namun, enzim restriksi tidak hanyamemotong DNA secara acak, juga tidak semua enzim restriksi memotong DNA di lokasiyang sama. Seperti enzim lainnya, enzim restriksi menunjukkan kekhususan untuk substrattertentu. Untuk enzim ini, substratnya adalah DNA. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a, enzim restriksi mengikat, mengenali, dan memotong mencerna DNA dalam urutanspesifik basa yang disebut situs restriksi. Mengapa enzim restriksi tidak mencerna DNAdalam bakteri sel? Bakteri melindungi DNA mereka dari pencernaan enzim restriksi karenabeberapa nukleotida dalam DNA mereka mengandung gugus metil yang menghambat enzimrestriksi dari pencernaan Gambar 1 b.Enzim restriksi biasanya disebut pemotong empat atau enam basa karena merekabiasanya mengenali situs restriksi dengan urutan empat atau enam nukleotida. Pemotongdelapan basis-pasangan juga telah diidentifikasi. Setiap situs restriksi adalah palindrom-susunan nukleotida membaca maju dan mundur yang sama pada untaian berlawanan darimolekul DNA. Ingat kata Madam atau frasa Toyota sebagai contoh palindrom. Beberapa enzim restriksi, seperti Eco RI, memotong DNA untuk membuat fragmen DNA denganmenggantung ujung beruntai tunggal yang disebut "lengket" atau ujung yang kohesif lihatGambar 1 a ; enzim lain menghasilkan fragmen dengan ujung berlipat ganda yang disebutujung tumpul. Tabel 1 menunjukkan beberapa enzim restriksi umum, mikroorganismesumbernya, dan situs restriksi mereka. Perhatikan bahwa tiga enzim pertama dalam tabeladalah pemotong enam basa yang menghasilkan molekul DNA dengan ujung yang keempat Taq I adalah pemotong empat basa yang menghasilkan ujung yang kohesif,dan tiga enzim yang lebih rendah menghasilkan fragmen DNA yang tumpul. Enzim yangmenghasilkan ujung yang kohesif sering kali lebih disukai daripada pemotong ujung tumpuluntuk banyak percobaan kloning karena fragmen DNA dengan ujung kohesif dapat denganmudah disatukan. DNA dari sumber apa pun seperti bakteri, manusia, anjing, kucing, katak,dinosaurus, atau sisa-sisa manusia purba dapat dicerna oleh enzim restriksi tertentu selamaDNA memiliki situs restriksi untuk enzim itu. Dalam arti paling sederhana, penemuan enzimrestriksi memberi para ahli biologi molekuler "gunting" yang dibutuhkan untuk melakukankloning GGGCAA T TGCAA T TCohesive ends aC AAT TUnmethylated DNA Cleavage Restrictionenzyme EcoRI EcoRIrestrictionsite33 553 35 5 Gambar Pembatasan dan Tindakan Pembatasan Enzim a Pencernaan DNA oleh Eco RImenghasilkan fragmen DNA dengan ujung yang kohesif. B Metilasi situs pembatasan EcoRI oleh enzim Eco RI metilase memblokir pembelahan DNA oleh Eco RI. Catatan Metilasisitus restriksi Eco RI terjadi pada nukleotida adenin, tetapi metilasi lebih sering terjadi padanukleotida sitosin. ALAT PERDAGANGANEnzim RestriksiEnzim restriksi adalah "gunting" canggih yang digunakan ahli biologi molekuleruntuk memanipulasi DNA. Bekerja dengan batasan Enzim menjadi lebih mudah selama 30tahun, sejak Hamilton Smith dan yang lainnya memelopori penggunaannya. Lebih dari 300enzim restriksi tersedia secara komersial dan tidak mahal. Banyak enzim sudah tersediakarena mereka telah dikloning menggunakan teknologi DNA rekombinan, sehingga merekadibuat dan diisolasi dalam jumlah besar. Enzim yang disiapkan secara komersial hadir dalamkemasan yang nyaman dengan solusi buffer yang menyediakan semua komponen yangdiperlukan untuk aktivitas enzim yang optimal. Jika para peneliti harus bekerja dengan enzimyang tidak mereka kenal, mereka dapat menggunakan database enzim restriksi REBASE, alatyang luar biasa untuk menemukan pemasok enzim dan spesifik itu, berbagai paket perangkat lunak dan situs web tersedia untuk membantupara ilmuwan yang bekerja dengan enzim restriksi dan sekuens DNA. Sebagai contoh,bayangkan Anda adalah seorang ahli biologi molekuler yang baru saja mengkloning danmengurutkan 7,200-bp sepotong DNA dan Anda ingin melihat apakah ada enzim yang akanmemotong gen Anda untuk membuat potongan-potongan DNA 250-bp untuk penyelidikanyang Anda lakukan. ingin membuat. Belum lama ini, jika Anda memiliki banyak enzimdalam freezer, Anda bisa mencerna DNA ini dan menjalankan gel untuk melihat apakah Andabisa mendapatkan potongan 250-bp, tetapi pendekatan yang tidak tepat ini membutuhkanbanyak waktu dan sumber daya. Jika Anda telah mengurutkan gen Anda, Anda dapatmemindai urutan dengan mata Anda, mencari tempat pembatasan yang menarik upaya yangsangat memakan waktu dan melelahkan mata! Internet membuat tugas ini jauh lebih mudah,karena banyak situs web berfungsi sebagai alat online untuk menganalisis situs pemotonganenzim restriksi. Misalnya, dalam Webcutter, urutan DNA dapat dimasukkan dan dicari untukmenentukan pola pemotongan enzim restriksi lihat masalah 8 dalam “Pertanyaan &Kegiatan”.C T T A AG G C AA T TEcoRI methylase GG C CAAAAT TT TCH3CH3 b Unmethylated DNA Methylated DNA EcoRI will not cleave methylated DNA Restriction enzymeEcoRI3 3 5 53 35 5 Penerapan teknik DNA rekombinan yang tersebar luas di banyak bidang penelitianbiologi dan medis telah menghasilkan ratusan buku teknik, situs web, dan jurnal. DalamBioteknik jurnal bulanan populer, ahli biologi menerbitkan dan berbagi informasi tentangteknik kloning molekuler. Beberapa situs yang biasa digunakan untuk mendesain primerPCR, dan aplikasi lain disediakan di Keeping Current Web Links, di situs web awal 1970-an, Paul Berg, Herbert Boyer, Stanley Cohen, dan rekan-rekannya diStanford University menggunakan kloning gen untuk mengubah biologi molekulerselamanya. Berg menemukan teknologi DNA rekombinan ketika ia menciptakan sepotongDNA rekombinan dengan menggabungkan menyambung DNA dari kromosom E. coli danDNA dari virus primata yang disebut SV40 virus simian 40. Pertama-tama DNA kromosomyang diisolasi dari E. coli dan DNA dari SV40. Kemudian dia memotong kedua sampel DNAdengan Eco RI, menambahkan E. coli DNA dan fragmen DNA virus ke tabung reaksi denganenzim DNA ligase, dan berhasil menciptakan molekul hibrida dari SV40 dan DNA E. penemuan ini sepenuhnya diakui ketika Paul Berg memenangkan Hadiah Nobel1980 dalam bidang Kimia untuk percobaan ini, yang menunjukkan bahwa DNA dapatdipotong dari sumber berbeda dengan enzim yang sama dan bahwa fragmen restriksi dapatdigabungkan untuk membuat molekul DNA rekombinan. Berg membagikan hadiah inidengan Walter Gilbert dan Frederick Sanger, yang secara mandiri mengembangkan metodeuntuk mengurutkan DNA suatu proses yang akan kita bahas nanti dalam bab bekerja dengan DNA kromosom; Cohen tertarik pada biologi molekulerpotongan DNA kecil yang dikenal sebagai plasmid. DNA plasmid terutama ditemukan padabakteri. Plasmid terutama ditemukan, dan dianggap DNA ekstrachromosomal karena merekaada dalam sitoplasma bakteri di samping kromosom bakteri. Plasmid berukuran kecil; denganrata-rata sekitar hingga pasangan basa bp dalam ukuran dan merekamereplikasi diri; yaitu, mereka menggandakan secara independen dari kromosom. Cohenmempelajari replikasi plasmid, transfer plasmid antara bakteri, dan mekanisme resistensibakteri terhadap antibiotik. Cohen menyebutkan bahwa plasmid dapat digunakan sebagai vektor potongan-potongan DNA yang dapat menerima, membawa, dan mereplikasi mengkloning potongan-potongan DNA lainnya. Cohen dan Boyer bekerja dengan dua plasmid bakteri untukmengkloning DNA dengan sukses. Mereka menerbitkan hasil yang menggambarkanpercobaan ini pada tahun 1973. Banyak yang menganggap karya ini sebagai kelahiraninformal teknologi DNA rekombinan. Menggunakan Eco RI, enzim restriksi yangsebelumnya diisolasi oleh Herbert Boyer, mereka memotong kedua plasmid dan kemudianmenyatukan fragmen dari masing-masing plasmid bersama-sama menggunakan DNA ligaseuntuk membuat plasmid hibrida rekombinan baru. Ingat bahwa DNA ligase mengkatalisasipembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida. Ligase dapat bergabung bersama DNAdengan ujung kohesif serta fragmen tumpul. Sebagai hasil dari eksperimen ini dan lainnya,Cohen dan Boyer menghasilkan vektor plasmid pertama untuk keperluan kloning, yangdisebut pSC101 dan dinamai "SC" untuk Stanley Cohen. pSC101 mengandung gen untukresistensi tetracycline dan situs restriksi untuk beberapa enzim termasuk Eco RI dan Hin penelitian selanjutnya mereka menggunakan eksperimen serupa untuk mengkloningDNA dari katak cakar berujung Afrika Selatan Xenopus laevis model organisme pentinglainnya dalam genetika dan biologi perkembangan ke situs Eco RI pSC101. Gambar 2mengilustrasikan bagaimana DNA rekombinan dapat dibentuk dalam proses yang serupadengan yang digunakan dalam eksperimen Cohen dan Boyer. Gambar 2. Membuat DNA RekombinanEcoRI mengikat ke urutan tertentu 5'-GAATTC-3 ' dan kemudian memotong tulangpunggung DNA, menghasilkan fragmen DNA. Ujung terfragmentasi dari fragmen DNAdapat membentuk ikatan hidrogen satu sama lain karena mereka memiliki pasangan basayang saling melengkapi. DNA ligase kemudian dapat mengkatalisasi pembentukan ikatankovalen di tulang punggung DNA dari fragmen untuk membuat sepotong DNA dan Boyer telah menciptakan vektor kloning DNA pertama wahana untukpenyisipan dan replikasi DNA dan pada 1980 diberikan paten untuk pSC101 dan untuk tekniksplicing dan kloning gen yang telah mereka kembangkan. Eksperimen-eksperimen inimengantarkan lahirnya bioteknologi modern, karena banyak dari teknik saat ini yang digunakan untuk kloning gen dan manipulasi gen didasarkan pada metode mendasar dariteknologi DNA rekombinan 1974, sebagai hasil langsung dari eksperimen Berg, Cohen, dan Boyer, paraperintis kloning dan kritikus menyuarakan keprihatinan tentang keamanan organisme yangdimodifikasi secara genetis. Para ilmuwan khawatir tentang apa yang mungkin terjadi jikabakteri rekombinan meninggalkan laboratorium atau jika bakteri tersebut dapat mentransfergen mereka ke sel lain atau bertahan hidup di organisme lain, termasuk manusia. Pada tahun1975, sebuah kelompok yang diundang dari para ahli biologi molekuler terkenal, ahlivirologi, ahli mikrobiologi, pengacara, dan jurnalis berkumpul di Pusat Konferensi Asilomardi Pacific Grove, California, untuk membahas manfaat dan potensi bahaya dari teknologiDNA rekombinan. Sebagai hasil dari pertemuan Asilomar yang bersejarah, National Institutesof Health NIH membentuk Komite Penasihat DNA Rekombinan RAC, yang ditugaskanuntuk mengevaluasi risiko teknologi DNA rekombinan dan menyusun pedoman untukpenelitian DNA rekombinan. Pada tahun 1976, RAC menerbitkan seperangkat pedomanuntuk bekerja dengan organisme rekombinan. RAC terus mengawasi penelitian kloning gen,dan kepatuhan terhadap pedoman RAC adalah wajib bagi para ilmuwan yang bekerja denganorganisme Sel Bakteri Dan Seleksi Antibiotik Rekombinan BakteriCohen juga membuat kontribusi penting lainnya untuk kloning gen, yangmemungkinkan eksperimen kloning pSC101 menjadi mungkin. Laboratoriumnyamenunjukkan bagaimana transformasi, suatu proses untuk memasukkan DNA asing ke dalambakteri, dapat digunakan untuk secara andal memperkenalkan DNA ke dalam bakteri. Cohenmenemukan bahwa jika ia memperlakukan sel-sel bakteri dengan larutan kalsium klorida,menambahkan plasmid ke sel-sel yang didinginkan di atas es, dan kemudian sel dihangatkansecara singkat dan DNA bercampur, plasmid masuk ke dalam sel bakteri. Di dalam selbakteri, plasmid mereplikasi dan mengekspresikan gen mereka. Teknik transformasi dijelaskan secara lebih rinci nanti. Metode transformasi yang lebih modern, yang disebutelektroporasi, melibatkan penerapan pulsa singkat milidetik dari listrik bertegangan tinggiuntuk membuat lubang kecil di dinding sel bakteri yang memungkinkan DNA juga dapat digunakan untuk memperkenalkan DNA ke dalam sel mamalia danmengubah sel tanaman. Ligasi fragmen DNA dan transformasi dengan metode apa pun agak tidak ligasi, beberapa dari plasmid yang dicerna kembali ke dirinya sendiri untuk membuatplasmid resirkularisasi yang tidak memiliki DNA asing. Selama transformasi, sebagian besarsel tidak mengambil DNA. Sekarang setelah Anda mempelajari bagaimana DNA dapat dimasukkan ke dalamvektor dan dimasukkan ke dalam sel bakteri, kami mempertimbangkan bagaimana bakterirekombinan yang ditransformasikan dengan plasmid rekombinan dapat dibedakan darisejumlah besar bakteri yang tidak diubah dan sel bakteri yang mengandung DNA plasmidtanpa DNA asing. Proses penyaringan ini disebut seleksi karena dirancang untukmemudahkan identifikasi pemilihan untuk bakteri rekombinan sambil mencegahpertumbuhan pemilihan terhadap bakteri dan bakteri yang tidak diubah yang mengandungplasmid tanpa DNA dan Boyer menggunakan seleksi antibiotik, suatu teknik di mana sel-sel bakteriyang ditransformasi dilapisi pada pelat agar dengan antibiotik yang berbeda, sebagai carauntuk mengidentifikasi bakteri rekombinan dan sel-sel yang tidak berubah bentuk. Selamabertahun-tahun pemilihan antibiotik adalah pendekatan yang banyak digunakan. Teknikkloning modern sering memasukkan strategi seleksi yang lebih populer lainnya, sepertiseleksi "biru-putih" alasan untuk nama ini akan segera jelas. Dalam seleksi biru-putih, DNAdikloning ke situs restriksi dalam gen lacZ, seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 3. Ingatbahwa gen lacZ mengkodekan β-galaktosidase β-gal, enzim yang mendegradasi disakaridalaktosa menjadi glukosa monosakarida. dan galaktosa. Ketika terganggu oleh gen yangdisisipkan, gen lacZ tidak mampu menghasilkan β-gal fungsional. Bakteri yang ditransformasi dilapisi pada agar-agar yang mengandung antibiotikampisilin, dalam contoh ini. Bakteri yang tidak mengalami transformasi tidak dapat tumbuhdi hadapan ampisilin karena mereka kekurangan plasmid yang mengandung gen resistensiampisilin ampR. Tetapi pemilihan antibiotik saja tidak membedakan bakteri yangditransformasi dengan plasmid non rekombinan yang telah diresirkulasi dari plasmidrekombinan. Untuk mengidentifikasi bakteri dengan plasmid rekombinan, agar-agar jugaharus mengandung substrat kromogenik penghasil warna untuk βgal yang disebut X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside. X-gal mirip dengan laktosa dalam strukturdan berubah biru ketika dibelah oleh β-gal. Hasilnya, bakteri non rekombinan yangmengandung plasmid yang diikat kembali tanpa memasukkan DNA mengandung gen lacZfungsional, menghasilkan β-gal, dan berubah menjadi biru. Sebaliknya, bakteri rekombinandiidentifikasi sebagai koloni putih. Karena sel-sel ini mengandung plasmid dengan DNAasing yang dimasukkan ke dalam gen lacZ, βgal tidak diproduksi, dan sel-sel ini tidak dapatmemetabolisme X-gal. Oleh karena itu, melalui seleksi biru-putih, Bakteri nontransformasidan non rekombinan dipilih melawan dan koloni putih diidentifikasi atau dipilih sebagaikoloni yang diinginkan yang mengandung plasmid rekombinan. Koloni yang mengandungplasmid rekombinan adalah klon sel bakteri yang identik secara genetik masing-masing berisisalinan plasmid rekombinan. Gambar 3. Mengkloning Gen dalam Seleksi Plasmid dan Biru-Putiha Mata Ilmu Pengetahuan / Peneliti Foto., b Michael A. juga membuat kontribusi penting lainnya untuk gen kloning, yang membuatkloning pSC101. Transformasi adalah sebuah proses memasukkan DNA asing ke dalambakteri, bisa digunakan untuk membuktikan pengenalan DNA didalam bakteri. Cohenmenemukan bahwa perlakuan sel bakteri dengan larutan kalsium klorida, ditambahkan plasmid untuk sel didinginkan di dalam es, dan kemudian sel dihangatkan secara singkat danDNA bercampur, plasmid masuk ke dalam sel bakteri. Di dalam sel bakteri, DNA bereplikasidan secara cepat. Teknik transformasi menjelaskan lebih banyak penjelasan. Lebih modernmetode transformasi disebut elektroforesi, termasuk penggunaan secara singkat tekananlistrik tinggi untuk membuat celah kecil di dinding sel bakteri dan membiarkan DNA juga dapat digunakan untuk mengenal DNA di dalam sel mamalia dantranformasi sel fragmen DNA dan transformasi oleh beberapa metode yang tidakefisien. Selama penyambungan beberapa pengolaan penyambungan plasmid kembali secarasendiri untuk menciptakan peredaran kembali plasmid yang kurang bagian DNA. Selamatransformasi, sel dewasa tidak bertindak kita belajar bahwa DNA bisa memasuki ke dalam vektor dan mengenali didalam sel bakteri, kita memikirkan bagaimana bakteri rekombinan ditransformasi denganrekombinan plasmid bisa dibedakan dari ukuran besar nontransformasi bakteri dan sel bakteriyang berisi plasmid DNA tanpa DNA asing. Proses skrening ini disebut seleksi karena inidibuat untuk memfasilitasi identifikasi bakteri rekombinan yang mencegah perkembangantidak ada perubahan bakteri dan bakteri yang berisi plasmid tanpa DNA dan Boyer menggunakan seleksi antibiotik, teknik ini yang ditransfomasi selbakteri di dalam lapisan agar dengan antibiotik berbeda, sebagai cara untuk mengidentifikasibakteri rekombinan dan tidak ada perubahan sel. Selama bertahun seleksi antibiotik telahbanyak digunakan. Teknik modern kloning sering menjadi terkenal strategis seleksi, sepertiseleksi “blue-white”. Seleksi blue-white DNA adalah kloning pemotongan bagian di gen bakteri adalah penggambaran di dalam lapisan agar yang berisi antibiotikampicilin, contohnya tidak ada perubahan bakteri tidak tumbuh yang terdapat ampicilinkarena tidak ada plasmid berisi gen resiten ampicilin ampR. Tetapi seleksi antibiotik sendiritidak bisa membedakan transformasi bakteri dengan plasmid tidak rekombinan yang memiliki peredaran dari plasmid rekombinan. Untuk mengidentifikasi bakteri dengan plasmidrekombinan, agar harus mengandung kormogenik penghasil warna. Hasilnya, bakteri tidakrekombinan berisi plasmid yang menyambung kembali tanpa memasukkan DNA yangmengandung fungsi gen lac Z, penghasil β-gal, dan perubahan biru. Pengenalan Gen Kloning ManusiaEnzim restriksi, DNA ligase, dan plasmid adalah alat utama ahli biologi molekuleruntuk memanipulasi dan mengkloning gen dari hampir semua sumber. Dengan transformasi,para ilmuwan punya cara untuk memperkenalkan rekombinan DNA menjadi sel DNA rekombinan memungkinkan untuk memotong dan menyatukan fragmen-fragmen DNA, menyisipkan DNA ke dalam plasmid DNA yang dikloning menjadi plasmidbiasa disebut DNA penyisipan, dan menghasilkan sejumlah besar DNA penyisipan denganmemungkinkan bakteri menjadi pekerja untuk mereplikasi rekombinan. DNA. Jika fragmen DNA hasil kloning adalah gen yang mengkode produk protein, sel-selbakteri dapat digunakan untuk mensintesis produk protein dari gen kloning. Kamimenyebutnya mengekspresikan protein. Ahli biologi molekuler mengakui bahwa jika genmanusia dapat dikloning dan diekspresikan, teknologi DNA rekombinan akan menjadi alatyang tak ternilai dengan aplikasi yang kuat dan menarik dalam penelitian dan bakteri dapat tumbuh dalam persiapan skala besar, para ilmuwan dapat menghasilkansejumlah besar DNA hasil kloning dan mengisolasi sejumlah protein yang biasanya sangatsulit atau mahal untuk dimurnikan tanpa teknologi DNA rekombinan, berbagai protein berharga yang sulit diperolehdapat dihasilkan dari gen hasil kloning. Produk gen manusia pertama yang tersedia secarakomersial dari teknologi DNA rekombinan adalah insulin manusia, hormon peptida yangdiproduksi oleh sel-sel di pankreas yang disebut sel beta. Ketika glukosa darah naik misalnya,setelah makan makanan kaya gula insulin menurunkan glukosa darah dengan menstimulasipenyimpanan glukosa dalam sel-sel hati dan otot sebagai rantai panjang glukosa yang disebut glikogen. Individu dengan tipe I, atau tergantung insulin, diabetes mellitus tidakmemproduksi insulin sendiri. Sebagai akibat dari kekurangan insulin ini, penderita diabetesmengalami kadar gula darah yang terlalu tinggi hiperglikemia, yang, seiring waktu, dapatmenyebabkan kerusakan serius pada banyak organ tubuh. Pada tahun 1977, gen insulin dikloning menjadi plasmid, diekspresikan dalam sel-selbakteri, dan diisolasi oleh para ilmuwan di Genentech dinamai untuk gen etic en gineeringtech nology, perusahaan bioteknologi San Francisco yang dirintis pada tahun 1976 olehHerbert Boyer dan Robert Swanson. Genentech umumnya dianggap sebagai perusahaanbioteknologi pertama. Pada tahun 1982, bentuk rekombinan insulin manusia, yang disebut Humulin, menjadiproduk DNA rekombinan pertama yang disetujui untuk aplikasi manusia oleh AdministrasiMakanan dan Obat AS FDA. Tak lama setelah insulin tersedia, hormon pertumbuhan yangdigunakan untuk merawat anak-anak yang menderita bentuk kerdil dikloning, dan karenateknologi DNA rekombinan, berbagai macam protein penting secara medis lainnya yangdulunya sulit diperoleh dalam jumlah yang memadai menjadi mudah. tersedia. Sebelum teknologi DNA rekombinan, hormon penting seperti insulin dan hormonpertumbuhan harus diisolasi dari jaringan. Hormon pertumbuhan diisolasi dari kelenjarpituitari mayat manusia. Tidak hanya proses ini mahal dan tidak efisien, tetapi isolasi ini jugamembawa risiko memurnikan virus dan patogen lain sebagai kontaminan yang dapatditularkan kepada orang yang menerima hormon. Sekarang ada beberapa ratus produkteknologi DNA rekombinan di pasaran dengan aplikasi luas dalam penelitian dasar,kedokteran, dan pertanian. Dengan pemahaman dasar tentang teknik yang terlibat dalam memanipulasi sepotongDNA, pada bagian selanjutnya kita akan memeriksa beberapa aspek penting dari vektor DNAdan bagaimana vektor yang berbeda dipilih dan digunakan tergantung pada apa yang harusdicapai. 2. What Makes a Good Vector?Jumlah vektor DNA yang berbeda, fungsi vektor, dan aplikasi telah meningkat secarasubstansial sejak Stanley Cohen membuat pSC101. Plasmid masih merupakan vektor kloningyang paling umum digunakan karena memungkinkan untuk kloning rutin dan manipulasipotongan-potongan kecil DNA yang membentuk dasar bagi banyak teknik yang digunakansetiap hari di laboratorium biologi molekuler. Selain itu, cukup mudah untuk mengubah sel-sel bakteri dengan plasmid dan relatif mudah untuk mengisolasi plasmid dari sel-sel satu vektor plasmid yang banyak digunakan pertama kali, disebut pBR322, dirancanguntuk memasukkan gen untuk resistensi ampisilin dan tetrasiklin dan beberapa situs restriksiyang bermanfaat. Namun, vektor kloning plasmid telah direkayasa selama bertahun-tahununtuk menggabungkan sejumlah fitur penting lainnya yang membuat pBR322 Praktis Dari Vektor DNA KloningVektor kloning plasmid biasanya mencakup sebagian besar fitur yang diinginkan dan praktisberikut Ukuran, mereka harus cukup kecil agar mudah dipisahkan dari DNA kromosom bakteriinang. Asal replikasi ori, Situs untuk replikasi DNA yang memungkinkan plasmid untukbereplikasi secara terpisah dari kromosom sel inang. Jumlah plasmid dalam sel disebut nomorsalinan. Jumlah salinan normal plasmid di sebagian besar sel bakteri kecil biasanya kurangdari 12 plasmid per sel; namun, banyak dari plasmid kloning yang paling diinginkan dikenalsebagai plasmid dengan jumlah salinan tinggi karena mereka mereplikasi untuk membuatratusan atau ribuan salinan plasmid per sel. Beberapa situs kloning MCS, M MCS adalah segmen DNA dengan situs pengenalanuntuk berbagai enzim restriksi umum lihat Gambar 3a. Situs-situs ini direkayasa ke dalamplasmid sehingga pencernaan plasmid dengan enzim restriksi tidak menyebabkan hilangnya fragmen DNA. Sebaliknya, plasmid sirkular menjadi linier ketika dicerna dengan enzimrestriksi. MCS memberikan fleksibilitas besar dalam kisaran fragmen DNA yang dapatdikloning menjadi plasmid karena dimungkinkan untuk memasukkan fragmen DNA yangdihasilkan dengan memotong dengan banyak enzim berbeda. Gen penanda yang dapat dipilih, Gen ini memungkinkan untuk pemilihan dan identifikasibakteri yang telah ditransformasi dengan plasmid rekombinan. Beberapa penanda yang palingumum dipilih adalah gen untuk resistensi ampisilin ampR, resistensi tetrasiklin tetR, dangen lacZ yang digunakan untuk seleksi biru-putih. Urutan promotor RNA polimerase, Rangkaian ini digunakan untuk transkripsi RNA invivo dan in vitro oleh RNA polimerase. Ingat bahwa RNA polimerase menyalin DNA kedalam RNA selama transkripsi. In vivo, sekuens ini memungkinkan sel-sel bakteri untukmembuat RNA dari gen kloning, yang pada gilirannya mengarah pada sintesis protein. Secarain vitro, RNA yang ditranskripsi dapat mensintesis "probe" RNA, yang berguna dalammempelajari ekspresi gen Bagian 4. Sekuens primer sekuensing DNA, Sekuens ini memungkinkan sekuensing nukleotida darifragmen DNA kloning yang telah dimasukkan ke dalam plasmid Bagian 4.Tipe-tipe VektorSama seperti satu obeng tidak dapat digunakan untuk semua ukuran dan jenis sekrup,vektor plasmid bakteri tidak dapat digunakan untuk semua aplikasi dalam bioteknologi. Adabatasan bagaimana plasmid dapat digunakan dalam kloning. Salah satu batasan utama adalahukuran fragmen DNA yang dapat dimasukkan ke dalam plasmid. Ukuran insert biasanyatidak boleh melebihi sekitar 6 hingga 7 kilobase 1 kb = bp. Selain itu, kadang-kadangbakteri mengekspresikan protein dari gen eukariotik dengan buruk. Karena keterbatasan ini,ahli biologi molekuler telah mengembangkan banyak jenis vektor DNA lainnya, yangmasing-masing memiliki manfaat khusus tergantung pada aplikasi kloning. Tabel 2membandingkan fitur penting, sumber, dan aplikasi dari berbagai jenis vektor kloning. Tabel 2. Perbandingan Vektor DNA dan AplikasinyaVector Type Maximum InsertSize kbApplications LimitationsBacterial plasmid vectors circular ~ 6–12 DNA cloning, proteinexpression, subcloning, direct sequencing of insert DNA Restricted insert size;limited expression of proteins; copy number problems; replication restricted to bacteria Bacteriophage vectors linear ~ 25 cDNA, genomic and expression libraries Packaging limits DNA insert size; hostreplication problems Cosmid circular ~ 35 cDNA and genomic libraries, cloning large DNA fragmentsPhage packaging restrictions; not ideal for protein expression; cannot bereplicated in mammalian cells Bacterial artificial chromosomeBAC, circular ~ 300 Genomic libraries, cloning large DNA fragments Replication restrictedto bacteria; cannot beused for protein expression Yeast artificial chromosomeYAC, circular 200–2,000 Genomic libraries, cloning large DNA fragments Must be grown in yeast; cannot be usedin bacteria Ti vectorcircularVaries depending ontype of Ti vector usedGene transfer in plantsLimited to use in plant cells only; number of restriction sites randomly distributed; large sizeof vector not easily manipulatedVektor BakteriofagDNA dari bacteriophage lambda λ adalah salah satu vektor fag pertama yangdigunakan untuk kloning. Kromosom λ adalah struktur linear berukuran sekitar 49 kb. DNAyang dikloning dimasukkan ke dalam situs restriksi di tengah kromosom λ. Kromosomrekombinan kemudian dikemas ke dalam partikel virus secara in vitro, dan fag ini digunakanuntuk menginfeksi E. coli yang tumbuh sebagai rumput lapisan kontinu yang menutupilempeng. Di setiap ujung kromosom λ terdapat 12 sekuens nukleotida yang disebut situskohesif COS, yang dapat saling berpasangan satu sama lain. Ketika λ menginfeksi E. coli sebagai inang, kromosom λ menggunakan situs COS untuk diedarkan dan kemudiandireplikasi. Bacteriophage λl bereplikasi melalui proses yang dikenal sebagai siklus λ bereplikasi untuk membuat lebih banyak partikel virus, E. coli yang terinfeksidilisiskan untuk melisiskan berarti membelah atau pecah oleh λ, menciptakan zona bakterimati yang disebut plak, yang muncul sebagai tempat yang dibersihkan pada halaman plak mengandung jutaan partikel fag rekombinan. Keuntungan dari vektor-vektor iniadalah mereka memungkinkan untuk kloning fragmen DNA yang lebih besar hingga sekitar25 kb daripada plasmid. Vektor fag tidak lagi digunakan secara VektorVektor cosmid mengandung ujung COS dari DNA λ, asal replikasi plasmid, dan genuntuk resistensi antibiotik, tetapi sebagian besar gen virus telah dihapus. DNA dikloning ketempat restriksi dan kosmid dikemas menjadi partikel virus, seperti yang dilakukan denganvektor bakteriofag, dan digunakan untuk menginfeksi E. coli, di mana kosmid bereplikasisebagai plasmid dengan jumlah salinan rendah. Koloni bakteri terbentuk di atas piring, danrekombinan dapat disaring melalui seleksi antibiotik. Salah satu keuntungan dari kosmidadalah mereka memungkinkan untuk kloning fragmen DNA dalam kisaran 20 hingga sama seperti vektor fag, karena pengembangan jenis vektor lainnya, vektor kosmidtidak lagi sangat banyak digunakan dan memiliki aplikasi yang terbatas. Vektor ekspresi Vektor ekspresi protein memungkinkan untuk sintesis tingkat tinggi ekspresi proteineukariotik dalam sel bakteri karena mengandung urutan promotor prokariotik yangberdekatan dengan situs tempat DNA dimasukkan ke dalam plasmid. Bakteri RNApolimerase dapat mengikat promotor dan mensintesis sejumlah besar RNA untukdimasukkan, yang kemudian diterjemahkan menjadi protein. Protein kemudian dapatdiisolasi menggunakan teknik biokimia. Namun, tidak selalu mungkin untuk mengekspresikan protein fungsional pada bakteri. Sebagai contoh, ribosom bakteri kadang-kadang tidak dapat menerjemahkan urutan mRNA eukariotik. Jika protein diproduksi, iamungkin tidak terlipat dan diproses dengan benar, seperti yang terjadi pada sel eukariotikyang menggunakan organel untuk melipat dan memodifikasi protein. Selain itu, membuatbeberapa produk rekombinan pada bakteri dapat menjadi masalah karena E. coli sering tidakmengeluarkan protein; oleh karena itu vektor ekspresi sering digunakan dalam Bacillussubtilis, suatu strain yang lebih cocok untuk sekresi beberapa kasus, bakteri inang dapat mengenali protein rekombinan sebagaiprotein asing dan menurunkan protein, sedangkan dalam kasus lain protein yangdiekspresikan mematikan bagi sel bakteri inang. Virus tertentu, seperti SV40, dapatdigunakan untuk mengirimkan vektor ekspresi ke dalam sel mamalia. Biasanya vektor yangditurunkan dari SV40 berisi sekuens promotor viral yang kuat untuk transkripsi tingkattinggi dan sinyal tambahan poli A untuk menambahkan ekor poli A ke ujung 3 'darimRNA yang disintesis. Variasi vektor tersebut telah digunakan untuk terapi gen Buatan BakteriBacterial artificial chromosomes BACs adalah plasmid besar dengan jumlah salinanrendah hadir sebagai satu atau dua salinan dalam sel bakteri dan mengandung gen yangmengkode faktor-F unit gen yang mengendalikan replikasi bakteri. BAC dapat menerimasisipan DNA dalam kisaran 100 hingga 300-kb. BAC secara luas digunakan dalam ProyekGenom Manusia untuk mengkloning dan mengurutkan potongan-potongan besar Buatan RagiKromosom ragi buatan YAC adalah plasmid kecil yang tumbuh di E. coli dandimasukkan ke dalam sel ragi seperti Saccharomyces cerevisiae. YAC adalah versi miniaturdari kromosom eukariotik. YAC mengandung asal replikasi, penanda yang dapat dipilih, dua telomer, dan centromere yang memungkinkan replikasi YAC dan pemisahan ke dalam selanak selama pembelahan sel. Fragmen DNA asing dikloning ke situs pembatasan di pusatYAC. YAC sangat berguna untuk mengkloning fragmen besar DNA dari 200 kb menjadisekitar 2 megabase mb = 1 juta basis. Seperti BAC, YAC memainkan peran penting dalamupaya kloning Proyek Genom TiVektor Ti adalah plasmid yang terbentuk secara alami berukuran sekitar 200 kb yangdiisolasi dari bakteri Rhizobium radiobacter sebelumnya bernama Agrobacteriumtumefaciens dan baru-baru ini diganti nama berdasarkan data genom patogen tanaman yangditularkan melalui tanah yang menyebabkan suatu kondisi pada tanaman yang disebutpenyakit mahkota batu. . Ketika R. radiobacter memasuki tanaman inang, sepotong DNA T-DNA dari Ti plasmid Ti singkatan dari tumor-inducing memasukkan ke dalam hostkromosom. T-DNA mengkodekan untuk sintesis hormon yang disebut auksin, yangmelemahkan dinding sel inang. Sel-sel tanaman yang terinfeksi membelah dan membesaruntuk membentuk tumor empedu. Ahli genetika tanaman mengakui bahwa jika merekadapat menghilangkan auksin dan gen merugikan lainnya dari Ti plasmid, vektor yangdihasilkan dapat digunakan untuk mengirimkan gen ke dalam sel tanaman. Vektor Ti banyakdigunakan untuk mentransfer gen ke kita telah memeriksa berbagai jenis vektor dan aplikasinya, di bagianselanjutnya kita akan mengalihkan perhatian kita pada bagaimana para ilmuwan dapatmenggunakan teknologi DNA rekombinan untuk mengidentifikasi dan mengkloning genyang Bagaimana Anda mengidentifikasi dan mengkloning gen yang diinginkan ? Memotong dan menempel potongan DNA yang berbeda untuk menghasilkan molekulDNA rekombinan telah menjadi teknik rutin dalam biologi molekuler. Tetapi jenis percobaankloning yang telah kami jelaskan sejauh ini memungkinkan untuk kloning acak fragmenDNA berdasarkan situs pemotongan enzim restriksi, bukan kloning gen tunggal atau bagiantertentu dari DNA yang menarik. Misalnya, jika Anda tertarik untuk mengkloning gen insulindan Anda hanya mengambil DNA dari pankreas, memotongnya dengan enzim, dan kemudianmengikat DNA yang dicerna menjadi plasmid, Anda akan membuat ratusan ribu plasmidrekombinan dan bukan hanya plasmid rekombinan yang mengandung hanya gen insulin. Ahli biologi molekuler menyebut pendekatan ini kloning "senapan", karena banyakfragmen diklon secara acak sekaligus dan tidak ada gen individu yang secara spesifikditargetkan untuk kloning. Bagaimana Anda tahu plasmid rekombinan mana yangmengandung gen insulin? Selain itu, jika gen insulin atau urutan yang berdekatan tidakmemiliki situs restriksi untuk enzim restriksi yang Anda gunakan, Anda mungkin tidakmemiliki plasmid rekombinan yang mengandung gen insulin. Bahkan jika Anda memangmembuat plasmid dengan gen insulin, bagaimana Anda akan memisahkannya dari plasmidrekombinan lainnya? Jadi bagaimana Anda menemukan gen tertentu yang menarik dan hanyamengkloning urutan DNA yang ingin Anda pelajari? Pertanyaan-pertanyaan ini seringkalidapat dijawab dengan pendekatan kloning yang melibatkan perpustakaan pustaka DNA Membangun Koleksi gen klonBanyak strategi kloning dimulai dengan menyiapkan perpustakaan DNA - kumpulanfragmen DNA kloning dari organisme tertentu yang terkandung dalam bakteri atau virussebagai inangnya. Perpustakaan dapat disimpan untuk jangka waktu yang relatif lama dan"disaring" untuk memilih gen yang berbeda minat. Dua jenis perpustakaan biasanyadigunakan untuk kloning, perpustakaan DNA genom dan perpustakaan DNA komplementerperpustakaan cDNA. Gambar 4 pada halaman berikutnya menunjukkan bagaimanaperpustakaan genom dan perpustakaan cDNA dibangun. Gambar Perpustakaan DNA Genomik Manusia dan Perpustakaan cDNA a DNAmanusia dibelah dengan enzim restriksi untuk membuat serangkaian fragmen yang lebih kecilyang dikloning menjadi plasmid atau vektor lainnya. Perpustakaan genomik manusia terdiridari kumpulan bakteri yang masing-masing berisi fragmen DNA manusia yang teori, semua fragmen DNA dari genom akan diwakili di perpustakaan. B Dalamperpustakaan cDNA, mRNA diubah menjadi cDNA oleh enzim reverse transcriptase. Linkeryang mengandung situs pembatasan ditambahkan ke cDNA untuk membuat akhir yangkohesif. CDNA sekarang bisa dikloning menjadi plasmid untuk replikasi bakteri genomik versus cDNA Di perpustakaan genom, DNA kromosom dari jaringan yang menarik diisolasi dankemudian dicerna dengan enzim restriksi lihat Gambar 4a. Proses ini menghasilkan fragmenDNA yang mencakup seluruh genom organisme. Vektor plasmid, BAC, YAC, ataubacteriophage dicerna dengan enzim yang sama, dan DNA ligase digunakan untuk mengikatpotongan DNA genomik dan vektor DNA secara acak. Secara teori, semua fragmen DNAdalam genom akan dikloning menjadi vektor. Vektor rekombinan kemudian digunakan untukmengubah bakteri, dan setiap klon sel bakteri akan mengandung vektor rekombinan denganplasmid yang mengandung fragmen DNA genom. Anggap setiap klon sebuah "buku" di"perpustakaan" fragmen DNA ini. Salah satu kelemahan menciptakan jenis perpustakaanuntuk gen eukariotik ini adalah potongan-potongan DNA non-protein, yang disebut intron,dikloning di samping urutan pengkodean protein ekson. Karena mayoritas DNA dalamorganisme eukariotik terdiri dari intron, banyak klon di perpustakaan genomik akan berisipotongan-potongan DNA non-protein. Keterbatasan perpustakaan genomik lainnya adalahbahwa banyak organisme, termasuk manusia, memiliki genom yang sangat besar sehinggamencari gen yang diinginkan akan seperti mencari jarum di tumpukan perpustakaan cDNA, mRNA dari jaringan yang menarik diisolasi dan digunakanuntuk membuat perpustakaan. Namun, mRNA tidak dapat dipotong langsung dengan enzimrestriksi, sehingga mRNA harus dikonversi menjadi molekul DNA berlipat ganda. Enzimyang disebut reverse transcriptase RT digunakan untuk mengkatalisasi sintesis DNA untaitunggal dari mRNA lihat Gambar 4 b. Enzim ini dibuat oleh virus yang disebut retrovirusdinamakan demikian karena merupakan pengecualian terhadap aliran informasi genetik yangbiasa. Alih-alih memiliki genom DNA yang dapat digunakan untuk membuat RNA, retrovirusmemiliki genom RNA. Setelah menginfeksi sel inang, mereka menggunakan RT untukmengubah RNA menjadi DNA, sehingga mereka dapat mereplikasi. Humanimmunodeficiency virus HIV, agen penyebab dari immunodeficiency syndrome AIDS,adalah retrovirus. Retrovirus juga memiliki aplikasi penting dalam bioteknologi sebagaivektor terapi gen. Karena RT mensintesis DNA yang merupakan salinan mRNA yang tepat, itu disebut DNA komplementer cDNA. MRNA terdegradasi oleh pengobatan denganlarutan alkali atau dicerna secara enzimatik; kemudian DNA polimerase digunakan untukmensintesis untai kedua untuk membuat cDNA untai sekuens cDNA tidak harus memiliki situs restriksi yang nyaman di setiapujungnya, sekuens DNA pendek berganda yang disebut sekuens linker sering ditambahkansecara enzimatik ke ujung cDNA. Linker berisi situs pembatasan. Penghubung yang berbedauntuk situs pembatasan yang berbeda tersedia secara menambahkan tautan, cDNA sekarang dapat diikat ke situs pembatasan yangnyaman dalam vektor pilihan, sering kali berupa plasmid. Plasmid rekombinan kemudiandigunakan untuk mengubah satu keuntungan utama dari pustaka cDNA dibandingkan pustaka genom adalahbahwa pustaka adalah kumpulan gen yang diekspresikan secara aktif dalam sel atau jaringantempat mRNA diisolasi. Juga, intron tidak dikloning di perpustakaan cDNA. Sebaliknya,ketika DNA genom kloning, mengandung intron dan ekson dimasukkan ke dalam bakteri, sel-sel tidak dapat memisahkan mRNA yang ditranskripsi dari DNA ini dan menghilangkanintron. Untuk alasan ini, perpustakaan cDNA biasanya lebih disukai daripada perpustakaangenom ketika mencoba untuk mengkloning dan mengekspresikan gen yang lain dari pustaka cDNA adalah bahwa pustaka dapat dibuat dan disaringuntuk mengisolasi gen yang hanya diekspresikan dalam kondisi tertentu dalam suatu contoh, jika suatu gen diekspresikan hanya dalam jaringan yang dirangsang olehhormon, para peneliti membuat perpustakaan dari sel-sel yang distimulasi hormon untukmeningkatkan kemungkinan kloning gen yang sensitif hormon. Perpustakaan telah menjadiaspek rutin biologi molekuler sehingga banyak perusahaan menjual perpustakaan yang dibuatdari berbagai jaringan dari spesies yang berbeda. Salah satu kelemahannya adalah pustakacDNA bisa sulit dibuat dan disaring jika jaringan sumber dengan jumlah mRNA yangberlimpah untuk gen tidak tersedia. Tetapi seperti yang akan Anda pelajari, teknik yangdisebut reaksi rantai polimerase PCR sering dapat menyelesaikan masalah ini. Screening PerpustakaanBegitu pustaka genomik atau pustaka cDNA dibuat, harus disaring untukmengidentifikasi gen yang diinginkan. Salah satu teknik penyaringan perpustakaan yangpaling umum disebut hibridisasi koloni Gambar 5. Gambar 5. Hibridisasi Koloni Pemutaran Perpustakaan dengan Probe DNA untuk Mengidentifikasi Genyang DikloningDalam hibridisasi koloni, koloni bakteri dari perpustakaan yang mengandung DNArekombinan ditanam pada lempeng agar. Selaput nilon atau nitroselulosa ditempatkan di ataspiring, dan beberapa sel bakteri menempel pada membran di lokasi yang sama di mana mereka ditemukan di piring. Jika vektor bakteriofag digunakan, fag dipindahkan ke diperlakukan dengan larutan alkali untuk melisiskan bakteri dan mendenaturasikanDNA mereka, yang mengikat nilon sebagai molekul beruntai tunggal. Biasanya, nilonkemudian diinkubasi dengan probe DNA, sebuah fragmen DNA tunggal yang salingmelengkapi dengan gen yang diinginkan karena ia dapat mendasarkan pasangan denganikatan hidrogen ke DNA target yang akan dikloning. Probe "ditandai" atau dilabelimenggunakan nukleotida radioaktif atau, lebih umum, pewarna fluoresen atau senyawa lainyang dapat digunakan untuk mengkatalisasi reaksi pelepasan cahaya yang disebutchemiluminescence. Pewarna memungkinkan untuk melacak probe untuk menentukan dimana ia mengikat. Probe mengikat urutan pelengkap pada nilon suatu proses yang kemudian dicuci untuk menghilangkan kelebihan probe yang tidak terikat danterkena film fotografi dalam proses yang disebut autoradiografi. Di mana pun probe terikat kefilter, radioaktivitas dari probe radioaktif atau cahaya yang dilepaskan fluoresensi atauchemiluminescence dari probe nonradioaktif memaparkan butiran perak dalam kelimpahannya dari gen yang diinginkan, mungkin hanya ada beberapa koloniatau plak pada filter yang berhibridisasi dengan probe. Film dikembangkan untuk membuatrekaman permanen, yang disebut autoradiogram atau autoradiograf, yang kemudiandibandingkan dengan lempeng asli koloni bakteri untuk mengidentifikasi koloni mana yangmengandung plasmid rekombinan dengan gen yang diinginkan. Koloni-koloni ini sekarangdapat tumbuh dalam skala yang lebih besar untuk mengisolasi DNA yang ketika hibridisasi dilakukan menggunakan probe fluorescent atauchemiluminescent, instrumen pencitraan digital dapat digunakan untuk mendeteksipengikatan probe dan kemudian sebuah foto sejajar dengan lempeng bakteri untukmengidentifikasi koloni yang menarik. Jenis penyelidikan yang digunakan untuk skrining perpustakaan seringkali tergantungpada apa yang sudah diketahui tentang gen yang diminati. Misalnya, probe skrining seringkali merupakan gen yang dikloning dari spesies lain. Klon cDNA gen dari tikus atautikus seringkali merupakan penyelidikan yang sangat efektif untuk menyaring perpustakaangenomik atau cDNA manusia, karena banyak sekuens gen pada tikus dan tikus mirip denganyang ditemukan pada gen manusia. Jika gen yang diinginkan belum dikloning pada spesieslain tetapi beberapa informasi tersedia tentang urutan protein, serangkaian oligonukleotidayang disintesis secara kimia dapat dibuat berdasarkan prediksi kodon yang dapat mengkodeuntuk urutan protein yang diketahui. Jika beberapa urutan asam amino parsial diketahui untukprotein yang dikodekan oleh gen untuk dikloning, adalah mungkin untuk "bekerja mundur"dan merancang oligonukleotida berdasarkan nukleotida yang diprediksi yang dikodekanuntuk urutan asam amino. Selain itu, jika antibodi tersedia untuk protein yang dikodekan olehgen yang diinginkan, perpustakaan ekspresi, yang menghasilkan ekspresi protein padabakteri, dapat digunakan, dan perpustakaan dapat disaring dengan antibodi untuk mendeteksikoloni yang mengekspresikan protein rekombinan. . Penapisan perpustakaan jarang menghasilkan isolasi klon yang mengandung genpanjang penuh. Lebih umum untuk mendapatkan klon dengan potongan kecil gen yangdiminati salah satu alasan mengapa hal ini terjadi dengan pustaka cDNA adalah karenamungkin sulit untuk mengisolasi mRNA fulllength atau mensintesis cDNA full-length untukgen yang diminati. Ketika potongan-potongan kecil gen dikloning, para ilmuwan menyusunurutan potongan-potongan ini dan mencari urutan yang tumpang tindih. Potongan-potonganDNA yang tumpang tindih kemudian dapat disatukan menjadi seperti teka-teki dalam upayamerekonstruksi gen berdurasi penuh. Ini sering membutuhkan penapisan perpustakaanbeberapa kali, dengan sejumlah besar bakteri yang dilapisi dan digunakan untuk hibridisasikoloni. Mencari kodon start dan stop dalam potongan yang berurutan adalah salah satu carauntuk memprediksi apakah seluruh gen telah disatukan. Melalui proses ini, fragmen yangtumpang tindih dapat disatukan untuk mengumpulkan seluruh gen. Kemudian dalam bab ini kita akan membahas bagaimana strategi sekuensing senapankeseluruhan dapat memungkinkan para ilmuwan untuk mengurutkan seluruh genom. Karena studi genom, perpustakaan menjadi cara yang kurang umum untuk mengidentifikasi danmengkloning gen. Alih-alih menggunakan perpustakaan untuk mengidentifikasi satu ataubeberapa gen pada suatu waktu, genomik memungkinkan para ilmuwan untukmengidentifikasi urutan untuk semua gen dalam genom. Reaksi Rantai PolimeraseMeskipun perpustakaan sangat efektif dan biasanya digunakan untuk mengkloningdan mengidentifikasi gen yang diminati, reaksi rantai polimerase PCR adalah pendekatanyang jauh lebih cepat untuk mengkloning daripada membangun dan menyaring sering merupakan teknik pilihan ketika mengkloning gen tetapi juga memiliki banyakaplikasi lain. Dikembangkan pada pertengahan 1980-an oleh Kary Mullis, PCR ternyatamenjadi teknik revolusioner yang berdampak pada banyak bidang biologi molekuler. Padatahun 1993, Mullis memenangkan Hadiah Nobel Kimia untuk penemuannya. PCR adalahteknik untuk membuat salinan atau memperkuat urutan DNA tertentu dalam waktu di balik reaksi PCR sangat sederhana. Target DNA yang akan diamplifikasiditambahkan ke tabung berdinding tipis dan dicampur dengan deoksiribonukleotida dATP,dCTP, dGTP, dTTP, buffer, dan DNA polimerase. Sepasang primer berpasanganditambahkan ke dalam campuran. Primer adalah oligonukleotida DNA untai tunggal pendekyang panjangnya biasanya sekitar 20 hingga 30 nukleotida. Primer ini melengkapi nukleotidayang mengapit ujung yang berlawanan dari DNA target yang akan diamplifikasi Gambar 6.Tabung reaksi kemudian ditempatkan di pengendara sepeda termal. Dalam arti palingsederhana, pengendara sepeda termal adalah blok pemanas canggih yang mampu mengubahsuhu dengan cepat dalam interval waktu yang sangat singkat. Siklus termal mengambilsampel melalui serangkaian reaksi yang disebut siklus PCR Gambar 6. Gambar 6. Reaksi Rantai PolimeraseSetiap siklus terdiri dari tiga tahap. Pada tahap pertama, yang disebut denaturasi,tabung reaksi dipanaskan hingga sekitar 94 ° C hingga 96 ° C, menyebabkan pemisahan DNAtarget menjadi untaian tunggal. Pada tahap kedua, yang disebut hibridisasi atau anil, tabungkemudian didinginkan sedikit hingga antara 55 ° C dan 65 ° C, yang memungkinkan primeruntuk ikatan hidrogen ke basa pelengkap di ujung yang berlawanan dari urutan target. Selamaperpanjangan atau perpanjangan, tahap terakhir dari siklus PCR, suhu biasanya sedikitmeningkat sekitar 70 ° C hingga 75 ° C, dan DNA polimerase menyalin DNA target denganmengikat ujung 3 'dari masing-masing primer. dan menggunakan primer sebagai templat. DNA polimerase menambahkan nukleotida ke ujung 3 'dari setiap primer untuk mensintesisuntai akhir satu siklus lengkap, jumlah DNA target telah dua kali lipat. Pengendarasepeda termal ulangi ketiga tahap ini lagi sesuai dengan jumlah siklus yang ditentukan olehpeneliti, biasanya 20 atau 30 siklus. Keuntungan terbesar PCR adalah kemampuannya untukmemperkuat jutaan salinan DNA target dari sejumlah kecil bahan awal dalam waktu DNA target digandakan setelah setiap putaran PCR, setelah 20 siklus PCR, sekitar 1juta salinan 2 20 DNA target dihasilkan dari reaksi yang dimulai dengan satu molekul satu kunci PCR adalah jenis DNA polimerase yang digunakan dalam dan pendinginan berulang yang dibutuhkan untuk PCR akan mengubah sifat danmenghancurkan sebagian besar DNA polimerase hanya dalam beberapa siklus. Beberapasumber DNA polimerase yang sesuai dengan PCR tersedia. Salah satu enzim pertama danpaling populer untuk PCR dikenal sebagai Taq DNA polimerase. Taq diisolasi dari domainArchaea yang disebut Thermus aquaticus, spesies yang tumbuh subur di sumber air T. aquaticus diadaptasi untuk hidup di air panas pertama kali ditemukan di sumberair panas Taman Nasional Yellowstone, ia telah mengembangkan DNA polimerase yangdapat menahan suhu tinggi. Karena Taq stabil pada suhu tinggi, ia dapat menahan perubahansuhu yang diperlukan untuk PCR tanpa didenaturasi. Polimerase termostabil seperti Taqsangat penting untuk banyak variasi dan aplikasi berbeda dalam teknologi PCR. Misalnya, PCRwaktu-nyata atau kuantitatif qPCR, menggunakan pengendara sepeda termal khusus yangmemungkinkan para peneliti untuk mengukur reaksi amplifikasi ketika mereka terjadi. Kamiakan membahas qPCR nanti di bab ini. Tutorial yang sangat baik tentang PCR dapat dilihat disitus web Pusat Pembelajaran DNA Cold Spring Harbor yang terdaftar di Situs WebPendamping. PCR memiliki aplikasi luas dalam penelitian dan kedokteran, seperti membuat probeDNA, mempelajari ekspresi gen, memperkuat DNA dalam jumlah kecil untuk mendeteksipatogen virus dan infeksi bakteri, memperkuat DNA untuk mendiagnosis kondisi genetik,mendeteksi jumlah jejak DNA dari jaringan di tempat kejadian perkara, dan bahkanmemperkuat DNA purba dari jaringan fosil dinosaurus Gambar 7. Banyak aplikasi PCRdijelaskan di seluruh 7. Aplikasi PCRAmplifikasi DNA oleh PCR telah menjadi teknik penting dalam biologi molekuler denganberbagai aplikasi yang berbeda. Contoh beberapa aplikasi terkait bioteknologi yang lebihumum disajikan dalam gambar Kloning PCRPCR sering digunakan sebagai pengganti pendekatan skrining perpustakaan untukmengkloning gen karena cepat dan efektif Gambar 8. PCR ApplicationsHuman genetic testing & disease diagnosis Amplification of rare DNA from fossils Study gene expression RT-PCR and qPCR DNA cloning Forensic DNA analysisDiagnostic tests for diseasecausing pathogens testing human tissue and fluid samples for bacteria and viruses and testing food and water samples for bacterial contamination Human remains identification military ID of soldiers andremains ID at disaster sites such as the World Trade Centerin 2001 and the Indonesiantsunami of 2004Paternity testing and determiningfamily relationships Gambar 8. Kloning Gen dengan PCRKerugian dari kloning PCR adalah bahwa, untuk merancang primer, Anda perlumengetahui sesuatu tentang sekuens DNA yang mengapit gen yang Anda minati. Kloningoleh PCR adalah yang termudah jika gen telah dikloning pada spesies lain misalnya,menggunakan primer untuk gen yang dikloning sebelumnya dari tikus untuk mengkloninggen setara dari manusia. Ada banyak cara untuk mengkloning gen menggunakan PCR. Salah satu pendekatanmodern untuk kloning PCR mengambil keuntungan dari kekhasan menarik polimerasetermostabil. Saat DNA disalin, Taq dan polimerase lain yang digunakan untuk PCR biasanyamenambahkan nukleotida adenin tunggal ke ujung 3 'dari semua produk PCR Gambar 8.Setelah memperkuat sebuah gen target, produk PCR hasil kloning dapat diikat menjadiplasmid yang disebut vektor T. Vektor T mengandung nukleotida timin bertanda tunggal disetiap ujungnya yang dapat melengkapi pasangan dengan nukleotida adenin menggantungdalam produk PCR. Setelah diikat ke dalam vektor T, plasmid rekombinan yang mengandungDenature DNA,anneal primersT vector with single-strandedthymine nucleotide at each and subclone PCR product into T vectorAmplify DNA with Taq DNA polymerase, which adds “A” nucleotide to endof PCR product AAT Vector DNA Target DNA Gene to be clonedTAGCTATTATC GATAA55333 53 5 3535353 5 TransformbacteriaCloned PCR product GATACTATTATCATAG produk PCR hasil kloning dapat dimasukkan ke dalam bakteri dan urutan nukleotida-nyadapat ditentukan. Sekarang setelah Anda mempelajari beberapa strategi paling umum yang digunakanuntuk mengkloning gen, pada bagian selanjutnya kita akan mempertimbangkan berbagaipendekatan berbeda yang digunakan para ilmuwan untuk mempelajari gen yang dikloning. 4. Teknik Laboratorium dan Aplikasi Teknologi DNA RekombinanMengapa mengkloning DNA? Apa yang dapat Anda lakukan dengan gen hasilkloning? Ada banyak aplikasi kloning gen dan teknologi DNA rekombinan. Gambar 9merangkum aplikasi kloning gen yang umum. Pada bagian ini, kami menyajikan beberaparutin molekul penting teknik laboratorium biologi dan aplikasi dasar kloning 9. Aplikasi dari Teknologi DNA RekombinanElektroforesis Gel AgarosaElektroforesis gel agarosa adalah salah satu teknik laboratorium yang paling umumdigunakan dalam bekerja dengan DNA karena memungkinkan seseorang untuk memisahkan dan memvisualisasikan fragmen DNA berdasarkan ukuran Gambar 10 di halamanberikutnya. Agarose adalah bahan yang diisolasi dari rumput laut, dicairkan dalam larutanbuffer, dan dituangkan ke dalam baki plastik. Saat agarosa mendingin, ia membeku untukmembentuk gel semipadat horisontal yang berisi lubang-lubang kecil atau pori-pori tempatfragmen DNA akan melakukan perjalanan. Persentase agarosa yang digunakan untukmembuat gel menentukan kemampuannya untuk menyelesaikan fragmen DNA dari berbagaiukuran. Sebagian besar aplikasi umumnya melibatkan gel yang mengandung agarosa 0,5%hingga 2%. Gel dengan persentase agarosa yang tinggi katakanlah 2% lebih cocok untukmemisahkan fragmen DNA kecil karena mereka akan lebih mudah menembus pori-poridaripada fragmen besar, yang tidak berpisah dengan baik melalui gel padat. Persentaseagarosa yang lebih rendah lebih cocok untuk menyelesaikan fragmen DNA besar. Untuk menjalankan gel, itu terendam dalam larutan buffer yang akan menghantarkanlistrik. Sampel DNA dimasukkan ke dalam depresi kecil yang disebut sumur, dan arus listrikditerapkan melalui elektroda di ujung yang berlawanan dari gel. Pemisahan DNA denganelektroforesis didasarkan pada kenyataan bahwa DNA bermigrasi melalui gel sesuai denganmuatan dan ukurannya dalam pasangan basa. Tulang punggung gula-fosfat membuat DNAbermuatan negatif; oleh karena itu, ketika DNA ditempatkan di medan listrik, ia bermigrasike arah anoda kutub positif dan ditolak oleh katoda kutub negatif. Karena semua DNAbermuatan negatif terlepas dari panjang atau sumber, laju migrasi dan pemisahan DNAmelalui gel agarosa tergantung pada ukuran molekul DNA. Jarak migrasi berbanding terbalikdengan ukuran fragmen DNA, sehingga fragmen DNA besar bermigrasi jarak pendek melaluigel yang relatif lambat dan fragmen kecil bermigrasi lebih cepat. Pelacakan zat ditambahkan untuk memantau migrasi DNA selama waktu yang diinginkan dari elektroforesis, DNA dalam gel diwarnai menggunakanpewarna seperti etidium bromida, yang interkalasi menembus di antara pasangan basaDNA. Pewarna-pewarna ini berpendar saat terpapar sinar ultraviolet. Rekaman permanen geldiperoleh dengan memotret gel saat terkena sinar ultraviolet Gambar 10 b. Perhatikan bagaimana DNA E. coli yang dicerna oleh HindIII menghasilkan noda pita tidak sepertikumpulan fragmen diskrit yang divisualisasikan dengan DNA yang dicerna Hin ini disebabkan oleh ukuran besar kromosom E. coli dan sejumlah besar lokasipemotongan untuk Hin dIII; begitu banyak fragmen dibuat sehingga tidak mungkin untukmemvisualisasikan band diskrit. Anda akan menemukan teknik yang melibatkanelektroforesis gel agarosa di seluruh teks ini dan, sebagai siswa, Anda sangat mungkin belajaruntuk menjalankan gel agarosa selama pelatihan bioteknologi Anda.ab 8000 bp –4000 bp –2000 bp –1000 bp –500 bp –Gambar 10. Elektroforesis Gel Agarosaa Fragmen DNA dapat dipisahkan dan divisualisasikan oleh elektroforesis gel agarosa. b Foto gel agarosa diwarnai dengan etidium bromida. Jalur berlabel "Marker DNA" dimuatdengan standar ukuran DNA yang disiapkan secara komersial. Ini berfungsi sebagai tanggafragmen ukuran diketahui yang digunakan untuk menentukan ukuran sampel eksperimentalDNA yang dianalisis. Jalur berlabel "DNA tidak dipotong" menunjukkan DNA kromosomtanpa berat molekul tinggi dari fag; "DNA + Hin dIII" menunjukkan serangkaian fragmendiskrit yang dibuat ketika DNA dicerna dengan enzim restriksi Hin dIII. Jalur berlabel " DNA uncut" berisi DNA kromosom yang tidak tercerna, dan jalur yang berdekatanmenunjukkan DNA kromosom E. coli yang dicerna dengan Hin dIII DNA E. coli + HindIII. Michael A. Gen Pemetaan PembatasanPada hari-hari awal kloning gen, segera setelah gen dikloning, biasanya jenis petafisik gen akan dibuat untuk menentukan enzim restriksi yang memotong gen kloning danMarker DNAMarker DNA DNA Uncut DNA + Hin d IIIE. coli DNA UncutE. coli DNA + Hin d III untuk menentukan lokasi dari lokasi pemotongan ini. Mengetahui peta pembatasan gensangat berguna untuk membuat klon potongan kecil gen disebut subkloning danmemanipulasi banyak potongan DNA yang relatif kecil misalnya, 100 hingga bpuntuk mengurutkan DNA dan menyiapkan probe DNA untuk mempelajari gen membuat peta restriksi, DNA hasil kloning dikenai serangkaian cerna tunggal denganenzim restriksi dan juga cerna ganda dengan enzim gabungan; DNA yang dicerna kemudiandipisahkan oleh elektroforesis gel sampel DNA telah dicerna, dinilai, dan divisualisasikan oleh elektroforesisgel, membuat peta pembatasan yang sebenarnya adalah seperti merakit puzzle. Seperti yangdiilustrasikan dalam Gambar 11, dengan membandingkan satu cerna dengan masing-masingdouble digest, peneliti dapat mengatur fragmen dalam urutan yang benar untuk membuat petasitus restriksi. DNA cut withGambar 11. Pemetaan BatasanLokasi situs pembatasan untuk Bam HI dan Pst I ditentukan dalam sebuah fragmen DNAyang panjangnya 7 kb. Pencernaan dengan Bam HI memotong DNA menjadi dua fragmenberukuran 2,5 dan 4,5 kb, menunjukkan bahwa DNA dipotong pada satu situs yang terletak2,5 kb dari satu ujung. Pencernaan dengan Pst I memecah DNA menjadi dua fragmen pada1,5 dan 5,5 kb, menunjukkan bahwa DNA dipotong pada satu situs yang terletak 1,5 kb darisatu ujung. Intisari ganda dengan kedua enzim memecah DNA menjadi tiga fragmen, 3,0 kb,2,5 kb, dan 1,5 kb. Karena fragmen tidak dibuat oleh pencernaan Bam HI atau Pst Isaja, ia harus mewakili DNA yang terletak di antara lokasi pemotongan Bam HI dan Pst "teka-teki" fragmen ini disusun, menjadi jelas bahwa peta pembatasan di bagian– + Uncut DNABam HIDNA cut withPst IPst I DNA cut with Bam HI + Pst I Fragment size kb map kb kb kb bawah gambar adalah satu-satunya peta yang konsisten dengan pola fragmen yang dibuatoleh para pencerna dalam percobaan sekuensing DNA dari potongan DNA yang relatif kecil telah menjadi cukupumum, pemetaan pembatasan sekarang biasanya dilakukan dengan menggunakan perangkatlunak bioinformatika seperti Webcutter, dijelaskan dalam masalah 8 dalam "Pertanyaan &Kegiatan" di akhir bab ini untuk mengidentifikasi pembatasan memotong situs dalam urutanDNA tanpa harus benar-benar mencerna DNA dan buat peta secara eksperimen. Namun,karena sejarah pentingnya pemetaan pembatasan dan penggunaannya yang sesekali saat ini,masih bernilai untuk menyadari teknik DNASetelah gen dikloning, penting untuk menentukan urutan nukleotida gen, urutannyayang tepat dari As, Gs, Ts, dan Cs. Mengetahui urutan DNA suatu gen dapat membantu 1untuk menyimpulkan urutan asam amino dari protein yang dikodekan oleh gen yangdikloning, 2 untuk menentukan struktur gen yang tepat, 3 untuk mengidentifikasi elemen-elemen pengatur seperti urutan promotor , 4 untuk mengidentifikasi perbedaan gen yangdiciptakan oleh penyambungan gen, dan 5 untuk mengidentifikasi mutasi genetik di antaraalasan metode pengurutan DNA tersedia termasuk teknik untuk pengurutan"siklus" PCR dan pengurutan DNA otomatis komputer, dan teknologi ini meningkat dengancepat setiap tahun. Awalnya, pendekatan sekuensing yang paling banyak digunakan adalahsekuens rantai-pemutusan, metode manual yang dikembangkan pada tahun 1977 olehFrederick Sanger dan sering disebut sebagai metode Sanger. Dalam teknik ini, primer DNAdiseragamkan menjadi DNA templat terdenaturasi, seperti plasmid rekombinan untukdiurutkan, dalam tabung reaksi yang mengandung deoksiribonukleotida dan DNApolimerase. Karena banyak plasmid modern dirancang dengan sekuensing situs pengikatan primer yang berdekatan dengan beberapa situs kloning, DNA polimerase dapat digunakanuntuk memperpanjang untaian komplementer dari ujung 3 'primer yang disatukan denganplasmid. Pendekatan asli digunakan urutan primer berlabel kecil nukleotida termodifikasi yang disebut dideoksiribonukleotidaddNTP dicampur dengan vektor, primer, polimerase, dan deoksiribonukleotida. SebuahddNTP berbeda dari deoksiribonukleotida normal dNTP karena ia memiliki gugus hidrogenyang melekat pada karbon 3 sugar dari gula deoksiribosa alih-alih gugus hidroksil-OH lihatGambar 12a di halaman berikutnya. Ketika ddNTP dimasukkan ke dalam rantai DNA, rantaitidak dapat diperpanjang karena tidak adanya 3'-OH mencegah pembentukan ikatanfosfodiester dengan nukleotida baru; karenanya, rantai tersebut “diakhiri.”Dalam pendekatan Sanger asli, empat tabung reaksi terpisah didirikan. Setiap tabungberisi vektor, primer, dan keempat dNTP, tetapi setiap tabung juga mengandung sejumlahkecil satu ddNTP. Ketika sintesis untai DNA baru dari primer dimulai, DNA polimerasesecara acak memasukkan ddNTP ke dalam urutan alih-alih dNTP normal, mencegah sintesislebih lanjut dari untai komplementer. Seiring waktu, ddNTP akan dimasukkan di semuaposisi di untaian yang baru disintesis, menciptakan serangkaian fragmen dengan panjangyang bervariasi yang diakhiri pada residu dideoksi. Untuk teknik Sanger asli, untai DNAdipisahkan pada gel poliakrilamida tipis, yang dapat memisahkan urutan yang berbedapanjangnya dengan nukleotida tunggal. Autoradiografi digunakan untuk mendeteksi fragmensequencing radioaktif yang ditunjukkan pada Gambar 12c. Urutan yang ditentukan dariradiogram otomatis adalah "dibaca" dari bawah ke atas sebagai nukleotida individu. Sepertiyang ditunjukkan pada Gambar 12 c, urutan yang ditentukan dari autoradiogram merupakanpelengkap dari urutan pada untai cetakan dalam vektor. Gambar 12. Sekuensing DNA Otomatis-Komputera Struktur dideoksinukleotida ddNTP. Perhatikan bahwa gugus 3 'yang melekat padakarbon adalah hidrogen daripada gugus hidroksil OH. Karena nukleotida lain tidak dapatdilampirkan pada ujung 3 'ddNTP, nukleotida ini adalah kunci untuk sekuensing DNA denganmetode Sanger seperti yang ditunjukkan b. Komputer-otomatis mendekati fragmen DNAmenggunakan gel kapiler. Laser dan detektor digunakan untuk mendeteksi fluoresensi setiapdideoksinukleotida. c Autoradiogram dari reaksi sekuensi dideoksi asli di mana radioaktifddNTP atau primer digunakan dan empat reaksi terpisah dilakukan. Huruf di atas jalur A, C,G, dan T sesuai dengan ddNTP tertentu yang digunakan dalam reaksi sekuensing yangdianalisis di jalur. Menganalisis sekuensing Sanger dengan autoradiografi sebagian besarsudah usang telah digantikan oleh pendekatan sequencing otomatis-komputer seperti yangditunjukkan pada b dan teknologi sequencing generasi berikutnya Pfizer, Inc. KAMU PUTUSKANUntuk Mematenkan atau Tidak?Proyek Genom Manusia diselesaikan lebih cepat dari jadwal sebagian karenapersaingan antara pusat genom yang didanai publik dan perusahaan yang didanai secarapribadi seperti Celera Genomics, yang awalnya disutradarai oleh mantan peneliti NIH, CraigVenter. Saat berada di The Institute for Genomic Research TIGR, Venter dan rekannyaadalah ilmuwan pertama yang sepenuhnya mengurutkan genom organisme hidup, bakteriHaemophilus influenzae. Kelompok ini mengajukan paten pada urutan nukleotida untuk dan pada teknologi bioinformatika yang digunakan untuk menganalisis genom ini. Sebelumnya, Venter dan koleganya menggambarkan serangkaian percobaan di mana merekasecara acak mengkloning cDNA pendek dari sel otak manusia. Urutan pendek ini disebut tagurutan terekspresikan ESTs, secara teori dapat digunakan sebagai probe untukmengidentifikasi cDNA full-length. Beberapa EST Venter ditemukan identik dengan genyang telah dikloning atau sebagian gen; yang lain tampak sebagai sekuens gen baru atauDNA sampah. Berharap untuk mendapatkan hak kepemilikan atas gen full-length yang dapatdiidentifikasi dari EST Venter, TIGR mengajukan permohonan paten. Permintaan inimenimbulkan banyak kontroversi. Contohnya Haruskah para ilmuwan diizinkan mematenkan sekuens DNA dari organisme yang hidupsecara alami? Bagaimana jika suatu paten diberikan hanya untuk bagian-bagian kecil dari gen bahkan jikatidak ada yang tahu apa yang dilakukan urutan DNA hanya karena beberapa individu atauperusahaan menginginkan hak paten untuk mengklaim bahwa mereka telah mengkloningsepotong DNA terlebih dahulu? Bagaimana jika tidak ada kegunaan yang jelas untuk sekuens DNA yang dikloning? Dapatkah atau haruskah peneliti yang menggunakan microarray gen atau membuatperpustakaan DNA diizinkan untuk mematenkan seluruh genom dari organisme apa pun yangtelah mereka pelajari? Ketika mereka diberikan paten, para ilmuwan pada dasarnya memiliki monopoli informasiyang dipatenkan selama dua dekade sejak tanggal pengajuan paten. Banyak yang percayabahwa penimbunan informasi genom bertentangan dengan tradisi berbagi informasi untukmemajukan ilmu pengetahuan. Akankah pemberian paten memperlambat kemajuan dalamkloning gen jika kelompok menimbun data dan tidak berbagi informasi? Bisakah atauharuskah suatu kelompok mempertaruhkan klaim gen, sehingga mencegah orang lainmengerjakannya atau mengembangkan suatu produk darinya? Bagaimana dengan individu yang mencari tahu apa yang harus dilakukan dengan gen? Haruskah organisme hidup yang direkayasa secara genetis dipatenkan? Bakteri rekayasamisalnya, yang digunakan untuk membersihkan polusi lingkungan dan hewan transgeniktelah dipatenkan, seperti halnya gen-gen penting secara klinis seperti beta interferon. Dapatkah suatu kelompok mengklaim hak untuk mengantisipasi penggunaan gen di masadepan bahkan jika tidak ada data untuk mendukung klaim tersebut? Bagaimana jika sekuens gen terlibat dalam suatu penyakit di mana terapi genetik dapatdikembangkan?Sejak 1980, Kantor Paten dan Merek Dagang telah memberikan paten pada lebihdari gen atau sekuens gen, dan diperkirakan 20% gen manusia telah ilmuwan khawatir bahwa paten yang diberikan hanya dengan mengkloningsepotong DNA memberikan paten untuk pekerjaan yang terlalu sedikit. Banyak ilmuwanpercaya bahwa lebih tepat untuk mematenkan teknologi baru yang digunakan untukmenemukan dan mempelajari gen dan aplikasi teknologi genetika seperti pendekatan terapigen daripada mematenkan urutan gen itu sendiri. Secara umum sebagian besar paten genmencakup penggunaan teknologi untuk sekuens, seperti tes genetik, dan bukan sekuens DNAitu sendiri. Dari sudut pandang komersial, satu keuntungan dari mematenkan adalah memberikan paten finansial kepada perusahaan swasta untuk mendapatkan obat atauteknologi ke pasar dan memungkinkan mereka memperoleh untung setelah jutaan atau miliardalam beberapa kasus dari dolar dihabiskan untuk R&D untuk membuat suatu mematenkan atau tidak? Kamu Otomatis Komputer Throughput Tinggi Menggantikan Teknik SekuensingSanger Asli Karena keterbatasan dalam menjalankan gel sekuensing, metode Sanger asli hanyadapat digunakan untuk mengurutkan sekitar 200 hingga 400 nukleotida dalam satu reaksitunggal; oleh karena itu, dalam mengurutkan bagian DNA yang lebih panjang misalnya, pasangan basa perlu untuk menjalankan beberapa reaksi untuk membuat urutan yangtumpang tindih yang dapat disatukan untuk menentukan keseluruhan, urutan berkelanjutandari pasangan basa. Karena keterbatasan ini, pendekatan sekuensing Sanger adalah metode rumit untukupaya sekuensing skala besar seperti yang digunakan untuk Proyek Genom Manusia. Proyekini selesai lebih cepat dari jadwal sebagian karena pengembangan metode sekuensing DNAotomatis-komputer yang mampu mengurutkan DNA dalam jangka panjang lebih dari 500 bpdalam satu reaksi. Awalnya reaksi sekuensing otomatis komputer menggunakan ddNTPs,masing-masing dilabeli dengan pewarna fluoresen nonradioaktif yang berbeda, atau primersekuensing berlabel di ujung 5 'dengan pewarna Gambar 12. Sebuah tabung reaksi tunggaldigunakan, dan pendekatan gaya manual menggunakan gel poliakrilamida diikuti olehautoradiografi telah diganti dengan memisahkan reaksi sekuensing pada jalur tunggal daritabung gel diameter ultrathin yang disebut gel kapiler. Saat fragmen DNA bergerak melaluigel, mereka dipindai dengan sinar laser. Laser merangsang pewarna fluoresen pada setiapfragmen DNA, yang memancarkan panjang gelombang cahaya yang berbeda untuk setiapddNTP. Cahaya yang dipancarkan dikumpulkan oleh detektor yang menguatkan dankemudian mengumpan informasi ini ke komputer untuk memproses dan mengubah polacahaya dan mengungkapkan urutan DNA Gambar 13. Sequencer DNA otomatis seringkali mengandung banyak gel kapiler yang panjangnyabeberapa kaki, memungkinkan banyak basis untuk dipisahkan. Oleh karena itu beberapainstrumen menjalankan sebanyak 96 gel kapiler, masing-masing memproduksi sekitar 900basis urutan. Dengan instrumen ini menjadi mungkin untuk menghasilkan sekitar 2 juta basisurutan dalam sehari. Akibatnya, sequencers ini dikenal sebagai sequencers throughput tinggikarena kemampuan mereka untuk memproses dan menghasilkan sejumlah besar data sekuensdalam periode waktu yang relatif 13. Teknologi Sequencing Generasi Berikutnya Roche 454 Teknologi sequencing Roche 454 mengikat fragmen DNA menjadi manik-manik. FragmenDNA diamplifikasi oleh PCR dan kemudian ditambahkan ke sumur Langkah 1 dandikenakan pyrosequencing, seperti yang dijelaskan dalam teks. Langkah 2 Selamapyrosequencinging, nukleotida fluoresens individu, G biru yang ditunjukkan dalam kasus ini,dialirkan ke sumur. Sebagai nukleotida ditambahkan ke primer oleh DNA polimerase,pirofosfat anorganik PPi dilepaskan yang bereaksi dengan adenosin 5'-fosfosulfat APSdan enzim sulfurylase untuk menghasilkan ATP panah biru. Enzim luciferase fireflymenggunakan ATP untuk menghasilkan cahaya, yang dapat dideteksi dan diukur. Langkah 3Cahaya yang ditangkap oleh sistem deteksi dianalisis untuk melacak pola nukleotida yangditambahkan ke masing-masing sumur. Siklus aliran selanjutnya diulang dengan masing-masing dari tiga nukleotida lainnya. Siklus berkelanjutan dari proses ini menghasilkanpembacaan sekuensing sekitar 400 basis. Diadaptasi dari “Perkembangan dan DampakUrutan 454” Volume 26, Edisi 10, 2008, Nature Biotechnology by Nature PublishingCompany. Direproduksi dengan izin Macmillan Publishers Ltd. dan Nature Publishing Groupdalam format Journal via Copyright Clearance Sequencing NGSGenomics telah mendorong permintaan untuk sequencer yang lebih cepat dan mampumenghasilkan jutaan basis urutan DNA dalam waktu yang relatif singkat, yang mengarah kepengembangan teknologi sequencing generasi berikutnya NGS yang dirancang untukmenghasilkan rangkaian urutan DNA yang sangat akurat dan panjang, lebih besar dari 1gigabase miliar basa DNA per reaksi, dengan biaya rendah. Pendekatan sekuensing generasiberikutnya menghilangkan teknik Sanger dan metode elektroforesis kapiler yang mendukungformat paralel yang canggih format reaksi simultan yang menggunakan teknik pencitraanfluoresensi canggih. Teknologi NGS menyediakan kapasitas yang belum pernah terjadisebelumnya untuk menghasilkan sejumlah besar data urutan DNA dengan cepat hingga 200kali lebih cepat daripada pendekatan Sanger dalam beberapa kasus dan dengan biaya yangsangat rendah per untuk melakukan sekuensing generasi berikutnya di antara komunitaspenelitian dan tantangan seperti genom $ dibahas kemudian dalam bab ini telahmenyebabkan perlombaan teknologi yang intens di antara banyak perusahaan yang inginmenghasilkan metode NGS. Pada tahun 2005, Roche 454 Life Systems adalah perusahaanpertama yang mengkomersialkan teknologi sequencing generasi berikutnya Gambar 13.Pendekatan ini mengurutkan genom menggunakan apa yang disebut metode fase padat dimana manik-manik melekat pada DNA genom yang terfragmentasi, yang kemudiandiamplifikasi dengan PCR dalam tetesan air terpisah dalam minyak untuk setiap manik, dimuat ke dalam pelat multiwell, dan dicampur dengan DNA polimerase. Pelat multiwellsering mengandung lebih dari satu juta sumur dengan satu manik per sumur, masing-masingberfungsi sebagai tabung reaksi untuk pengurutan lihat Gambar 13. Reaksi yang disebutpyrosequencing kemudian digunakan untuk mengurutkan DNA pada manik-manik di setiapsumur. Dalam pyrosequencinging, nukleotida berlabel tunggal mis., DGTP mengalir di atassumur. Setiap sumur berisi satu manik bersama dengan primer dianil ke DNA pada nukleotida komplementer melintasi untai templat yang berdekatan dengan primer,ditambahkan ke ujung 3 'primer dengan DNA polimerase. Penggabungan nukleotidamenghasilkan pelepasan pirofosfat, yang mengawali serangkaian reaksi chemiluminescentpelepasan cahaya yang pada akhirnya menghasilkan cahaya dengan menggunakan enzimluciferase firefly. Cahaya yang dipancarkan dari reaksi ditangkap dan direkam untukmenentukan kapan nukleotida tunggal telah dimasukkan ke dalam untaian. Denganmengulangi langkah aliran nukleotida secara cepat dengan masing-masing dari empatnukleotida untuk menentukan basis mana yang berikutnya dalam urutan, pendekatan ini dapatmenghasilkan panjang baca sekitar 400 basis dan pada urutan 400 juta basis Mb data per10- jam berjalan. Teknologi sekuensing NGS juga menciptakan tantangan besar dalammanajemen data untuk menyimpan dan menyimpan file data gambar berukuran besar. Perusahaan Applied Biosystems ABI telah mengembangkan pendekatan yangdisebut SOLID didukung ligasi dan deteksi oligonukleotida yang dapat menghasilkan 6gigabase data urutan per proses! Metode SOLID menggabungkan berbagai pendekatan untuksekuens fragmen DNA yang terkait dengan manik-manik dan diperkuat, mirip denganpendekatan 454, tetapi teknologi sekuensing yang berbeda digunakan, yang dapatmemberikan output yang lebih besar dari data sekuensing per instrumen yang untuk menjalankan platform ini mahal, tetapi mengingat sejumlah besar urutanyang dapat dihasilkan metode NGS, biaya rata-rata per basis jauh lebih rendah daripadasekuensing Sanger. Hingga 2006, teknologi pengurutan baru memotong setengah biayapengurutan setiap 2 tahun. Bekerja pada sequencer generasi ketiga sedang berlangsung dan ada alasan untukpercaya bahwa instrumen ini akan tersedia pada pertengahan pertengahan dekade ini. Sebagaicontoh, satu pendekatan yang menjanjikan di cakrawala langsung melibatkan penggunaannanoteknologi dengan mendorong DNA beruntai tunggal fragmen menjadi nanopori dankemudian membelah pangkalan individu untuk menghasilkan sinyal yang dapat ini tidak melibatkan amplifikasi DNA atau tag fluoresen dan dengan demikianmemberikan urutan langsung dari DNA dalam satu untai in situ HibridisasiTeknik yang disebut Fluorescence In Situ Hibridisasi FISH; in situ berarti "ditempat" dapat digunakan untuk mengidentifikasi kromosom mana yang mengandung genyang diminati. Misalnya, jika Anda baru saja mengkloning gen manusia yang diyakini terlibatdalam kecerdasan, Anda bisa menggunakan IKAN untuk menentukan kromosom mana yangberada dalam gen ini. Pada IKAN, kromosom diisolasi dari sel-sel seperti sel darah putih danmenyebar pada slide mikroskop kaca. Probe DNA atau RNA untuk gen yang menarik dilabelidengan nukleotida fluoresens dan kemudian diinkubasi dalam larutan dengan slide. Probehibridisasi dengan urutan pelengkap pada kromosom pada slide. Slide dicuci dan kemudianterkena cahaya neon. Di mana pun probe terikat ke kromosom, probe berlabel fluoresensimenyala untuk menunjukkan adanya ikatan yang mengikat Gambar 14. Gambar 14. Fluoresensi dalam Hibridisasi SituBintik-bintik putih di ujung setiap kromosom menunjukkan fluoresensi dari probe yangmengikat telomer. Peter Lansdorp. Untuk menentukan mana dari 23 kromosom manusia yang menunjukkan fluoresensi,mereka diselaraskan sesuai dengan panjang dan pola pewarnaan kromatidnya untuk membuatkariotipe. Fluoresensi pada lebih dari satu kromosom menunjukkan beberapa salinan gen atausekuens terkait yang mungkin menjadi bagian dari keluarga gen. IKAN juga digunakan untukmenganalisis kelainan genetik. Sebagai contoh, analisis FISH dapat dilakukan pada kariotipekromosom janin dari wanita hamil untuk menentukan apakah janin yang sedang berkembangmemiliki jumlah kromosom yang abnormal. Ketika gen diekspresikan dalam organ dengan banyak jenis sel yang berbedamisalnya, jaringan ginjal atau otak IKAN juga dapat digunakan untuk menentukan tipe selyang mengekspresikan mRNA tertentu. Dalam pendekatan ini, jaringan yang menarikdipertahankan dalam larutan fiksatif dan kemudian tertanam dalam bahan atau resin sepertililin. Hal ini memungkinkan para peneliti untuk mengiris jaringan menjadi beberapa bagiantipis setebal 1 sampai 5 mm dan menempelkannya pada slide mikroskop. Kadang-kadangbagian jaringan yang beku digunakan untuk percobaan ini. Slide tersebut diinkubasi denganRNA atau DNA probe yang diberi pewarna fluoresen untuk gen yang diinginkan. Probehibridisasi ke mRNA di dalam sel di tempat asalnya dan pengikatan probe ditentukan denganmendeteksi fluoresensi. Untuk beberapa penelitian, PCR bahkan dapat dilakukan secaralangsung pada bagian jaringan in situ sebagai cara untuk menentukan ekspresi tipe sel untukgen yang BlottingTeknik lain, yang disebut analisis Southern blot Southern blot atau hibridisasi,sering digunakan untuk menentukan nomor salinan gen di antara aplikasi lain. Dikembangkanoleh Ed Southern pada tahun 1975, Southern blotting dimulai dengan mencerna DNAkromosom menjadi fragmen kecil dengan enzim DNA dipisahkan oleh elektroforesis gel agarosa Gambar 15. Namun,jumlah fragmen restriksi yang dihasilkan dengan mencerna DNA kromosom seringkali sangatbesar sehingga hanya menjalankan gel dan pewarnaan DNA tidak menyelesaikan fragmendiskrit. Sebaliknya, DNA yang dicerna muncul sebagai noda kontinu pada gel. Southernblotting digunakan untuk memvisualisasikan hanya fragmen minat tertentu. Setelahelektroforesis, gel diperlakukan dengan larutan alkali untuk mendenaturasi DNA; kemudianfragmen dipindahkan ke membran nilon atau nitroselulosa menggunakan teknik yang dapat dicapai dengan membuat sandwich gel di mana gel ditempatkan dibawah membran nilon, kertas saring, kertas tisu, dan pemberat untuk memungkinkanperekatan larutan garam melalui gel, yang akan mentransfer DNA ke nilon dengan aksi kapiler Gambar 15. Untai tunggal menempel pada noda, diposisikan dalam pita persisseperti pada gel. Atau, penekan tekanan atau vakum dapat digunakan untuk mentransfer DNAke nilon. Noda nilon kemudian dipanggang atau terkena sinar UV sebentar untuk menempelDNA secara permanen. Selanjutnya blot diinkubasi dengan probe berlabel dengan cara yangsama seperti hibridisasi koloni dilakukan. Semakin banyak, probe nonradioaktif digunakanuntuk Southern blotting dan banyak teknik hibridisasi dicuci untuk menghilangkan probe asing dan kemudian terkena film denganautoradiografi jika radioaktif atau chemiluminescent probe digunakan. Di mana pun probeterikat pada blot, radioaktivitas atau cahaya yang dilepaskan oleh probe akanmengembangkan butiran perak pada film untuk mengekspos pita pada blot, menciptakanautoradiogram lihat Gambar 15. Probe Chemiluminescent juga dapat dideteksi oleh sistempencitraan kamera digital. Dengan menginterpretasikan jumlah pita yang terungkap,dimungkinkan untuk menentukan nomor salinan analisis Southern blot adalah teknik penting, yang membentukprinsip-prinsip dasar untuk Northern blotting pemisahan dan blotting molekul RNA, sepertiyang dibahas di bagian selanjutnya dan Western blotting pemisahan dan blotting protein.Teknik blotting Utara dan Barat tidak dinamai setelah ilmuwan bernama "Utara" dan "Barat";alih-alih, mereka disebut sebagai rujukan lidah ke pipi kepada Ed Southern, pendiri Southernblots. Southern blotting memiliki banyak aplikasi lain, termasuk pemetaan gen, identifikasigen-keluarga terkait, deteksi mutasi genetik, konfirmasi produk PCR, dan sidik jari yang sangat baik tentang bagaimana analisis Southern blot digunakan dalam sidikjari DNA dapat ditemukan di situs web Pusat Pembelajaran DNA Cold Spring Harbor, yangdapat ditemukan di Situs Web Pendamping.a BamHI EcoRI BamHIGene of * Labeled probe interest complementary to gen of interestbRestrictionDNA + restriction enzyme fragmentsI II III – + Agarose gel 1 Restriction fragment preparation2 Electrophoresis, then treat gel with NaOH to denature DNA with probe5 Detect probe binding by autoradiography, chemiluminescence or other imaging 15. Analisis Southern Blot dari Fragmen-Fragmen DNAa Wilayah DNA untuk gen yang menarik untuk dipelajari dengan analisis Southern blot b Langkah-langkah yang terlibat dalam Southern blottingMempelajari Ekspresi GenAhli biologi molekuler di seluruh dunia terlibat dalam penelitian yang mempelajari ekspresigen dan regulasi ekspresi gen. Banyak teknik molekuler yang berbeda tersedia untukmempelajari ekspresi gen. Sebagian besar metode melibatkan menganalisis mRNA yangdiproduksi oleh jaringan. Ini sering merupakan ukuran yang baik dari ekspresi gen karenajumlah mRNA yang dihasilkan oleh suatu jaringan seringkali setara dengan jumlah proteinyang dihasilkan oleh Northern BlotMetodologi dasar blot Utara mirip dengan analisis blot Selatan. Di Northern blotting, RNAdiisolasi dari jaringan yang menarik dan dipisahkan oleh elektroforesis gel RNA tidakdicerna dengan enzim. RNA dihilangkan ke membran nilon dan kemudian diseragamkan keprobe, seperti yang dijelaskan untuk Southern blots. Pita yang terpapar pada autoradiogrammenunjukkan keberadaan mRNA untuk gen yang diinginkan dan ukuran mRNA Gambar 16BamHI EcoRI I II III Labeled DNA marker of known sizes III III Rinse away unattached probe Markers a. Selain itu, jumlah mRNA yang dihasilkan oleh jaringan yang berbeda dapat dibandingkandan diukur.ab2345678500 bp –Actin300 bp –Defensin100 bp –Gambar 16. Menganalisis Ekspresi Gen oleh Northern Blot Analysis dan RT-PCRNorthern blot analysis dan RT-PCR adalah dua teknik umum untuk menganalisis jumlahmRNA yang dihasilkan oleh jaringan ekspresi gen. a Blot 1 adalah bagian dariautoradiogram dari percobaan blotting Utara di mana RNA dari empat jaringan tikus, 1,vesikula seminalis; 2, ginjal; 3 dan 4, segmen berbeda dari epididimis organ reproduksi priadisikat ke nilon dan kemudian diperiksa dengan probe cDNA radioaktif untuk gen yangterlibat dalam melindungi jaringan dari kerusakan oleh radikal bebas yang berbahaya, atom,1234 Blot 2 Blot 3 Blot 1 atau molekul dengan jumlah yang tidak berpasangan dari elektron. Perhatikan bagaimanajumlah mRNA yang terdeteksi di jalur 3 dan 4 seperti yang ditunjukkan oleh ukuran dankegelapan masing-masing band lebih besar daripada jumlah mRNA di jalur 1 dan 2. Blot 2menunjukkan autoradiogram dari blot 1 yang dilucuti dari batas Probe dan reprobed denganProbe untuk gen yang berbeda. Blot 3, blot yang sama ditunjukkan pada dua panel lainnya,dilucuti dari probe terikat dan reprobed dengan cDNA radioaktif untuk gen cyclophilin yangdiekspresikan pada tingkat yang hampir sama di hampir semua jaringan. B Agarosa gel daripercobaan RT-PCR di mana RNA dari jaringan tikus ditranskripsi ulang dan diamplifikasidengan primer untuk -aktin komponen penting dari sitoplasma sel dan / atau -defensin-1gen yang mengkode peptida yang memberikan perlindungan terhadap infeksi bakteri dibanyak jaringan. Jalur 1 berisi standar ukuran DNA dari ukuran yang diketahui seringdisebut tangga yang meningkatkan 100-bp. Lane 2 adalah sampel kontrol negatif di manaprimer ditambahkan ke percobaan PCR tanpa cDNA. Lane 3 adalah sampel kontrol negatif dimana cDNA ditambahkan ke percobaan PCR tanpa primer. Perhatikan bahwa jalur 2 dan 3tidak menunjukkan produk PCR yang diperkuat karena amplifikasi tidak akan terjadi tanpacDNA sebagai DNA target jalur 2 atau tanpa primer jalur 3. Jalur 4 menunjukkan cDNAginjal diamplifikasi dengan primer aktin. Lane 5 menunjukkan cDNA ginjal yangdiamplifikasi dengan primer defensin. Jalur 6, 7, dan 8 menunjukkan produk PCR dari cDNAdari tiga jaringan reproduksi tikus berbeda yang diamplifikasi dengan primer aktin dandefensin. Perhatikan bagaimana jalur 6 dan 8 menunjukkan jumlah produk PCR aktin dandefensin yang relatif merata; jumlah yang lebih besar dari produk PCR defensin ditunjukkanpada jalur 7. Perbedaan-perbedaan ini mencerminkan jumlah yang berbeda dari defensinmRNA yang dibuat oleh jaringan-jaringan ini. a Michael A. Palladino., b Michael Transkripsi PCRTerkadang jumlah RNA yang dihasilkan oleh jaringan di bawah tingkat deteksi dengananalisis Northern blot. PCR memungkinkan untuk mendeteksi jumlah mRNA yang sangatkecil dari jumlah jaringan awal yang sangat kecil. Sebagai contoh, PCR telah menjadi alatyang hebat bagi ahli biologi molekuler yang mempelajari ekspresi gen dalam embrio danmengembangkan jaringan di mana jumlah jaringan untuk analisis sangat kecil. Karena RNAtidak dapat secara langsung diperkuat oleh PCR, teknik yang disebut reverse transcriptionPCR RT-PCR dilakukan. Dalam RT-PCR, mRNA terisolasi dikonversi menjadi cDNA untaiganda oleh enzim reverse transcriptase dalam proses yang mirip dengan cara di mana cDNAuntuk perpustakaan dibuat. CDNA kemudian diamplifikasi dengan sekumpulan primerkhusus untuk gen yang diinginkan. Fragmen DNA yang diamplifikasi dielektroforesis pada agarosa gel dan dievaluasi untuk menentukan pola ekspresi dalam jaringan lihat Gambar 16b. Jumlah cDNA yang dihasilkan dalam reaksi RT-PCR untuk gen tertentu yang menarikmencerminkan jumlah mRNA, dan dengan demikian tingkat ekspresi gen, untuk gen tertentudalam jaringan Time PCRPCR waktu-nyata atau kuantitatif qPCR, memungkinkan peneliti untuk mengukur reaksiamplifikasi seperti yang terjadi dalam “waktu nyata” Gambar 17. Ada beberapa cara untukmenjalankan reaksi PCR real-time, tetapi prosedur dasarnya melibatkan penggunaanpengendara sepeda termal khusus yang menggunakan laser untuk memindai berkas cahayamelalui bagian atas atau bawah setiap tabung PCR. Setiap tabung reaksi mengandung probeyang mengandung pewarna atau pewarna yang mengikat DNA yang memancarkan cahayaneon ketika diterangi oleh laser. Cahaya yang dipancarkan oleh pewarna ini berkorelasidengan jumlah produk PCR yang diamplifikasi. Cahaya dari setiap tabung ditangkap olehdetektor, yang menyampaikan informasi ke komputer untuk memberikan pembacaan jumlahfluoresensi setelah setiap siklus; pembacaan ini dapat diplot dan dianalisis untuk mengukurjumlah produk PCR yang dihasilkan setelah setiap pendekatan yang umum digunakan untuk PCR real-time melibatkanpenggunaan probe TaqMan dan pewarna yang disebut SYBR Green. SYBR Green mengikatDNA untai ganda. Karena lebih banyak DNA untai ganda disalin dengan setiap putaran PCRwaktu-nyata, ada lebih banyak salinan DNA untuk mengikat SYBR Green, yangmeningkatkan jumlah cahaya neon yang TaqMan adalah pelengkap untuk daerah tertentu dari DNA target antara dimana primer maju dan mundur untuk PCR mengikat Gambar 17. Probe TaqMan berisi duapewarna. Satu pewarna, reporter, terletak di ujung 5 'dari probe dan dapat melepaskan cahayafluoresens ketika tereksitasi oleh sinar laser dari pengendara sepeda termal. Pewarna lain,yang disebut quencher, adalah terlampir pada ujung probe 3. Ketika kedua pewarna ini saling berdekatan, pewarna quencher mengganggu cahaya neon yang dilepaskan dari pewarnareporter. Namun, karena Taq DNA polimerase meluas setiap primer, ia menghilangkanpewarna reporter dari ujung probe dan akhirnya menghilangkan seluruh probe. Sekarangpewarna reporter dipisahkan dari quencher, cahaya fluorescent yang dikeluarkan oleh reporterdapat dideteksi oleh pengendara sepeda termal. Cahaya yang terdeteksi dianalisis olehkomputer untuk menghasilkan plot yang menampilkan jumlah fluoresensi yang dipancarkanpada setiap siklus. Karena PCR real-time tidak melibatkan gel yang berjalan, itu adalahteknik yang kuat dan cepat untuk mengukur dan mengukur perubahan dalam ekspresi gen,terutama ketika banyak sampel dan gen yang berbeda dianalisis secara bersamaan. 1. Hibridisasi. Memajukan dan membalikkan primer PCR mengikat DNA targetterdenaturasi. Probe TaqMan dengan reporter R dan pewarna quencher Q berikatandengan DNA target antara primer. Ketika probe utuh, emisi oleh pewarna reporter Perpanjangan. Saat DNA polimerase memperluas primer ke depan, ia mencapai probeTaqMan dan memotong pewarna reporter dari probe. Dirilis dari putaran Deteksi. Cahaya yang dipancarkan dari reporter terdeteksi dan ditafsirkan untukmenghasilkan plot yang menghitung jumlah produk PCR yang dihasilkan dengan setiapsiklus.a PrimerBasedUnder withb the reporter can now emit light when excited by a laser. 40 1620128High gene expressionLow gene expressionFluorescence40 32282436QR5555333DNA polymerase Can LargeGambar 17. PCR Waktu-Nyataa Metode TaqMan dari PCR waktu-nyata melibatkan sepasang PCR primer bersama dengansekuens penyelidikan yang melengkapi gen target. Probe berisi pewarna reporter R di satuujung dan pewarna quencher Q di ujung lainnya. Ketika pewarna quencher dekat denganpewarna reporter, pewarna itu mengganggu fluoresensi yang dilepaskan oleh pewarnareporter. Kapan Taq DNA polimerase memperluas primer untuk mensintesis untai DNA,memotong pewarna reporter dari probe, memungkinkan reporter mengeluarkan energi. bSetiap siklus PCR berikutnya menghilangkan lebih banyak pewarna reporter, sehinggapeningkatan cahaya yang dipancarkan dari pewarna dapat ditangkap oleh komputer untukmenghasilkan pembacaan intensitas fluoresensi dengan setiap GenAnalisis microarray DNA adalah teknik lain untuk mempelajari ekspresi gen yang dengancepat mendapatkan popularitas selama 15 tahun terakhir karena memungkinkan penelitiuntuk menganalisis semua gen yang diekspresikan dalam jaringan dengan sangat cepatGambar 18. Sebuah microarray, juga dikenal sebagai chip gen, dibuat dengan menggunakanslide mikroskop kaca kecil. Molekul DNA untai tunggal ditempelkan atau "dinodai" ke slidemenggunakan lengan robot berkecepatan tinggi yang dikendalikan komputer yang disebutarrayer, yang dilengkapi dengan sejumlah pin kecil. Setiap pin direndam dalam sejumlahkecil solusi yang mengandung jutaan salinan molekul DNA yang berbeda, seperti cDNAuntuk gen yang berbeda. Array memperbaiki DNA ini ke slide di lokasi tertentu titik atautempat yang direkam oleh komputer. Sebuah microarray tunggal dapat memilikiketertarikan. Maka cDNA yang disintesis dari mRNA ini adalah a diberi label denganpewarna fluorescent. CDNA berlabel diinkubasi semalaman dengan microarray di mana iaberhibridisasi dengan bintik-bintik pada microarray yang mengandung sekuens DNAkomplementer. Microarray dicuci dan microarray dapat digunakan untuk mempelajariekspresi gen. Para ilmuwan mulai dengan mengekstraksi ekstrak mRNA dari jaringan yang dipindai oleh laser yang menyebabkan cDNA yang dipibridisasi ke microarray menjadiberpendar. Bintik-bintik fluoresen mengungkapkan gen mana yang diekspresikan dalamjaringan yang diinginkan, dan intensitas fluoresensi menunjukkan jumlah relatif cerah titik, semakin banyak mRNA yang diekspresikan dalam jaringan juga dapat dijalankan dengan memberi label cDNA dari dua jaringan atau lebihdengan pewarna fluorescent berwarna berbeda. Gene pola ekspresi dari jaringan yangberbeda dibandingkan berdasarkan warna bintik yang muncul setelah hibridisasi dan banyak spesies, termasuk manusia, seluruh genom tersedia dalam peneliti juga menggunakan microarray untuk membandingkan pola gen yangdiekspresikan dalam jaringan dalam kondisi yang berbeda. Misalnya, sel kanker dapatdibandingkan dengan sel normal untuk mencari gen yang mungkin terlibat dalampembentukan kanker. Hasil dari studi microarray tersebut dapat digunakan untukmengembangkan strategi terapi obat baru untuk memerangi kanker dan penyakit dan Pemurnian ProteinBakteri yang telah ditransformasi dengan plasmid rekombinan sering dapatdigunakan untuk menghasilkan produk protein dari gen yang diisolasi. Sejumlah besar bakteridapat tumbuh di fermentor, dan proteinnya dapat diisolasi lebih dari tempat DNA,masing-masing berisi sekuens unik DNA untuk gen yang berbeda. Ada beberapa jenismicroarray. Gambar 18 menunjukkan contoh yang representatif tentang bagaimanaStudi Mutagenesis GenDari banyak cara berbeda yang digunakan para ilmuwan untuk mempelajari genkloning, ada beragam teknik yang dapat digunakan untuk mempelajari struktur dan fungsiprotein yang dihasilkan oleh gen tertentu. Salah satu pendekatan disebut mutagenesis terarah-situs. Dalam teknik ini, mutasi dapat dibuat dalam nukleotida spesifik dari gen kloning yangterkandung dalam vektor. Gen kemudian dapat diekspresikan dalam sel, yang menghasilkan translasi protein bermutasi. Hal ini memungkinkan peneliti untuk mempelajari efek mutasitertentu pada struktur protein dan berfungsi sebagai cara menentukan nukleotida yang pentinguntuk fungsi spesifik protein. Mutagenesis yang diarahkan pada situs dapat menjadi carayang sangat berharga untuk membantu para ilmuwan mengidentifikasi sekuens kritis dalamgen yang menghasilkan protein yang terlibat dalam penyakit RNAPada tahun 1998, peneliti Craig C. Mello dari University of Massachusetts MedicalSchool dan Andrew Z. Fire of Stanford University menerbitkan karya inovatif. Gambar 18. Analisis Gen Microarray1 Sam Ogden / Photo Researchers, Inc., 3 Volker Steger / Photo Researchers, Inc. di mana mereka menggunakan potongan RNA dsRNA untai ganda untuk menghambat ataumembungkam ekspresi gen dalam cacing gelang nematoda cacing elegans Caenorhabditiselegans. Mekanisme yang terjadi secara alami untuk menghambat ekspresi gen ini dikenalsebagai gangguan RNA RNAi. Sebagai Mello, Api, dan peneliti lain menemukan, dsRNAdapat diikat oleh enzim pencerna RNA yang disebut dicer, yang memotong dsRNA menjadipotongan molekul RNA yang berukuran 21 hingga 25 nukleotida yang disebut RNAinterfering kecil siRNAs.Degradation ofmRNA by SlicerInhibition ofmRNA translationGambar 19. Interferensi RNA1 RNA untai ganda dibelah oleh pemain dadu enzim menjadi siRNA. 2 Protein RISCmengikat siRNA dan menurunkan satu dari dua untai 3 untuk menghasilkan siRNA untaitunggal. 4 SiRNA untai tunggal berikatan dengan sekuens komplementer pada molekulmRNA dalam sitoplasma dan mengganggu ekspresi gen diam melalui pemicu degradasimRNA oleh slicer atau dengan menghambat terjemahan mRNA oleh ini terikat oleh kompleks protein-RNA yang disebut RNA-induced silencingcomplex RISC. RISC melepaskan siRNA untai ganda, melepaskan siRNA untai tunggalyang berikatan dengan urutan komplementer dalam molekul mRNA. Mengikat siRNAs keInhibition oftranscription1234DicerOne strand degraded Binds tomRNAsiRNA/RISC Binds to DNA RISC proteins including Slicer stranded RNA siRNA to 25-nt21-mRNA mRNA menghasilkan degradasi mRNA oleh slicer enzim atau memblokir terjemahandengan mengganggu pengikatan ribosom Gambar 19. RNAi serupa dalam mekanismedengan aksi pembungkaman gen dari miRNAs, tetapi perbedaan utama adalah bahwa siRNAdihasilkan dari tampak bahwa penemuan siRNA dan miRNA mungkin merupakan temuanyang relatif esoterik. Prediksi sekarang menunjukkan bahwa sel mamalia mengekspresikanribuan siRNA atau miRNA, dan ini pada gilirannya dapat mengatur ratusan gen. Perusahaanbioteknologi dan farmasi sedang mencari cara di mana siRNA dan miRNA dapat dieksploitasiuntuk tujuan terapeutik. Teknik menggabungkan RNAi telah berkembang pesat sebagaimetode untuk mengatur ekspresi gen dan sebagai cara potensial untuk menargetkan danmenonaktifkan gen tertentu dengan efisiensi tinggi. Kami akan mempertimbangkan contohbagaimana bioteknologi dan perusahaan farmasi bekerja pada teknik RNAi untukmembungkam gen yang terlibat dalam penyakit manusia nanti. RNAi telah menjadi teknologiyang berkembang pesat sehingga perkiraan terbaru menunjukkan penggunaan reagen RNAiakan tumbuh dari sekitar $ 400 juta pada tahun 2005 menjadi lebih dari $ 900 juta pada tahun2012. Hadiah Nobel Fisiologi atau Kedokteran tahun 2006 diberikan kepada Andrew Fire danCraig Mello atas nama mereka. Penemuan metode alami ini untuk mematikan gen. HadiahNobel biasanya diberikan puluhan tahun setelah pekerjaan yang terhormat selesai, jadipengakuan cepat yang luar biasa ini merupakan indikasi yang jelas tentang nilai RNAisebagai alat penelitian yang kuat dan Dan Bioinformatika Disiplin Bioteknologi TerkiniMengkloning masing-masing gen menggunakan perpustakaan dan teknik lain yangdijelaskan dalam bab ini akan terus digunakan dalam pendekatan khusus dalam teknologiDNA rekombinan. Namun selama lebih dari 15 tahun terakhir, sejumlah kemajuan dalamteknologi kloning dan sekuensing semakin mengarah pada penggunaan strategi untuk mengkloning, mengurutkan, dan menganalisis seluruh genom - ilmu yang menarik danberkembang pesat yang disebut genomik. Anda akan belajar tentang banyak aplikasi genomiksaat Anda mempelajari bioteknologi. Di sini kami memberikan pengantar tentang bagaimanapara ilmuwan dapat mempelajari seluruh “Shotgun” Seluruh GenomSekuat teknik rekombinan DNA tradisional, menjadi semakin jelas bahwa jika parailmuwan ingin mempelajari proses biologis kompleks yang melibatkan banyak gen sepertikebanyakan kanker — mengkloning satu atau bahkan beberapa gen pada satu waktu terlalulambat, hanya menghasilkan informasi tambahan tentang gen. Sebagai akibatnya, parailmuwan mulai bekerja pada strategi untuk mengkloning dan mengurutkan seluruh gen,strategi yang biasa disebut sekuensing “senapan” seluruh gen. Analoginya adalah bahwamengkloning masing-masing gen menggunakan perpustakaan setara dengan menggunakansenapan untuk mengenai tempat tertentu pada target misalnya Mengkloning gen tertentu,sedangkan pelet dari senapan akan secara acak mengenai banyak titik pada target dengansedikit presisi. Dalam sekuensing senapan, seluruh genom, intron dan ekson, genom lengkap dikumpulkan dengan bantuan program perangkat lunak, dankemudian masing-masing gen diidentifikasi melalui satu strategi senapan umum untuk membangun urutan seluruh kromosommelibatkan penggunaan enzim restriksi untuk mencerna potongan-potongan seluruhkromosom Gambar 20. Proses ini dapat menghasilkan ribuan fragmen yang tumpang tindihyang disebut contigs urutan yang berdampingan, yang harus diurutkan. Setiap contigdiurutkan, dan kemudian program komputer digunakan untuk menyelaraskan fragmenberdasarkan potongan urutan yang tumpang tindih Gambar 20 b. Pendekatan inimemungkinkan para ilmuwan untuk merekonstruksi seluruh urutan seluruh kromosom dan,seperti yang Anda lihat pada gambar, penggunaan komputer untuk mengatur danmembandingkan urutan DNA dari fragmen ini sangat penting. Ini adalah tindakan bioinformatika, bidang interdisipliner yang menerapkan ilmu komputer dan teknologiinformasi untuk mempromosikan pemahaman tentang proses tahun 1995, para ilmuwan di The Institute for Genomic Research adalah yangpertama menggunakan pendekatan senapan untuk berhasil mengurutkan genom organismemana pun ketika mereka mengurutkan 1,8 juta pasangan pasangan basa dari bakteriHaemophilus influenzae. Banyak yang meragukan bahwa strategi pengurutan senapan dapatdigunakan secara efektif untuk mengurutkan genom yang lebih besar, tetapi pengembanganteknik ini dan strategi pengurutan novel dengan cepat mempercepat kemajuan Proyek 3 42111 2 3 4 43EcoRI BamHI BamHI Genomic DNA DNA cut into multiple overlapping fragments contigs by digestionwith different restriction enzymes. a Search computer database determine if DNA sequence b Overlapping sequenced contigsalready been identied aligned using computer programs to assemble an entire chromosomeBioinformatika Menggabungkan Biologi Molekuler dengan Teknologi KomputasiKetika para ilmuwan mengurutkan gen atau urutan DNA yang baru diidentifikasi, merekamelaporkan temuan mereka dalam publikasi ilmiah dan mengirimkan data urutan ke databasesehingga ilmuwan lain yang mungkin tertarik pada informasi urutan ini dapat memiliki akseske sana. Manipulasi basis data data urutan DNA adalah di antara aplikasi pertamabioinformatika, yang melibatkan penggunaan perangkat keras dan perangkat lunak komputeruntuk mempelajari, mengatur, berbagi, dan menganalisis data yang berkaitan dengan strukturgen, urutan dan ekspresi gen, serta struktur dan fungsi data genom telah terakumulasi dengan cepat, menghasilkan sejumlah besarinformasi yang disimpan dalam database publik dan pribadi, bioinformatika telah menjadialat penting yang memungkinkan para ilmuwan untuk berbagi dan membandingkan data,Collection Library of Individual Fragments that are sequences terutama data sekuens DNA. Kami memperkenalkan bidang ini di sini dengan beberapaaplikasi yang sangat Bioinformatika dalam AksiBahkan sebelum proyek sekuensing seluruh genom dimulai, para ilmuwan mengumpulkaninformasi sekuens dari berbagai organisme yang berbeda, sehingga memerlukanpengembangan database canggih yang dapat digunakan oleh para peneliti di seluruh duniauntuk menyimpan, berbagi, dan memperoleh jumlah maksimum informasi dari protein danurutan DNA. Database adalah alat penting untuk pengarsipan dan berbagi data denganpeneliti dan publik. Karena teknik sekuensing DNA otomatis berkecepatan tinggi komputerdikembangkan hampir bersamaan dengan perluasan Internet sebagai alat informasi, banyakbasis data sekuens DNA tersedia melalui para ilmuwan yang telah mengkloning suatu gen memasukkan data sekuensmereka ke dalam basis data, basis data ini mencari sekuens baru terhadap semua sekuens laindalam database dan menciptakan keselarasan sekuens nukleotida yang serupa jika kecocokanditemukan Gambar 20a. Jenis pencarian ini sering kali merupakan salah satu langkahpertama yang diambil setelah gen dikloning menggunakan teknik DNA rekombinan karenapenting untuk menentukan apakah urutannya telah dikloning dan dipelajari atau apakahurutan gen itu adalah novel. Di antara aplikasi lain, basis data ini juga dapat digunakan untukmemprediksi urutan asam amino yang dikodekan oleh urutan nukleotida dan untukmemberikan informasi tentang fungsi gen satu basis data urutan DNA yang paling banyak digunakan di seluruh duniadisebut GenBank. Ini adalah basis data terbesar dari sekuens DNA yang tersedia untuk umumdan berisi kumpulan sekuens DNA National Institutes of Health NIH. GenBank berbagi danmemperoleh data dari basis data di Jepang dan Eropa. Dipertahankan oleh Pusat Nasionaluntuk Informasi Bioteknologi NCBI di Washington, GenBank berisi lebih dari 100miliar pangkalan data sekuens dari lebih dari spesies, dan tumbuh pesat setiap tahun. NCBI adalah tambang emas sumber daya bioinformatika yang menciptakan basis data aksespublik dan mengembangkan alat komputasi untuk menganalisis dan berbagi data juga telah merancang cara yang ramah pengguna untuk mengakses dan menganalisissejumlah besar data tentang sekuens nukleotida, sekuens protein, struktur molekul, datagenom, dan bahkan literatur Basis Data DNA Cobalah SendiriMisalnya, program NCBI yang disebut Basic Search Alignment Search Tool BLAST; dapat digunakan untuk mencari GenBank untuk kecocokanurutan antara gen yang dikloning dan untuk membuat keberpihakan urutan DNA. Pergi kesitus web BLAST dan klik “standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn].” Di kotakpencarian, ketik urutan berikut AATAAAGAAC CAGGAGTGGA. Bayangkan bahwa urutanini berasal dari sepotong gen yang baru saja Anda kloning dan diurutkan dan Anda ingin tahuapakah ada yang mengkloning gen ini sebelum Anda. Klik tombol "Ledakan!". Hasil Andaakan tersedia dalam satu atau dua menit. Klik tombol "Format!" Untuk melihat hasilpencarian Anda. Halaman akan muncul dengan hasil pencarian Anda Anda mungkin perlugulir ke bawah halaman untuk menemukan keselarasan urutan. Apa yang kamu temukan? Gambar 21 menunjukkan penyelarasan pencarian BLAST membandingkan urutangen manusia dan tikus untuk gen obesitas ob yang menghasilkan hormon yang disebutleptin. Leptin berperan dalam metabolisme lemak, dan mutasi pada gen leptin dapatberkontribusi pada obesitas. Perhatikan bahwa urutan nukleotida untuk kedua gen ini sangatmirip, seperti yang ditunjukkan oleh garis vertikal antara nukleotida Nomenklatur Genom Manusia, didukung oleh NIH, menetapkan aturanuntuk menetapkan nama dan simbol untuk gen manusia yang baru dikloning. Setiap entri keGenBank dilengkapi dengan nomor aksesi yang dapat digunakan para ilmuwan untukmerujuk kembali ke urutan kloning itu. Misalnya, buka situs web GenBank yang terdaftar diSitus Web Sahabat dan kemudian ketikkan nomor aksesi U14680 dan klik "GO." Gen apa yang diidentifikasi oleh nomor aksesi ini? Klik tautan nomor aksesi. Perhatikan bahwaGenBank memberikan referensi jurnal asli yang melaporkan urutan ini, kode asam aminosatu huruf dari protein yang dikodekan oleh gen ini, dan urutan nukleotida cDNA dari genini. Atau, Anda bisa mengetikkan nama gen atau gen potensial Anda tertarik untuk melihatapakah sudah dikloning dan dikirim ke GenBank. Pencarian BLAST akan mengidentifikasikecocokan dengan gen manusia untuk kanker payudara onset dini, BRCA1. PencarianGenBank mengidentifikasi gen yang sama dengan nomor aksesinya. GenBank hanyalah satucontoh dari basis data yang sangat berharga yang sangat penting bagi bioinformatika. Banyakbasis data khusus lainnya ada dengan informasi seperti data polimorfisme nukleotida tunggal,basis data perpustakaan BAC dan YAC, dan basis data protein yang membuat katalog urutanasam amino dan struktur protein tiga Kloning Genom dari Proporsi Epik Proyek Genom ManusiaIni adalah waktu yang sangat menyenangkan untuk belajar bioteknologi. Kamiberuntung menyaksikan penyelesaian proyek yang belum pernah terjadi sebelumnya yangmelibatkan banyak teknik yang dijelaskan dalam bab ini, Proyek Genom Manusia HGP.Diprakarsai pada tahun 1990 oleh Departemen Energi AS DOE, HGP adalah upayakolaborasi internasional dengan rencana 15 tahun untuk mengidentifikasi semua genmanusia, yang semula diperkirakan berjumlah hingga jumlahnya, dan untukmengurutkan sekitar 3 miliar pasangan basa. diperkirakan membentuk 24 kromosom manusia yang berbeda kromosom 1 hingga 22, X, Y. HGP juga dirancang untuk mencapai hal-halberikut Analisis variasi genetik di antara manusia. Ini termasuk identifikasi polimorfismenukleotida tunggal SNP. Memetakan dan mengurutkan genom organisme model, termasuk bakteri, ragi,cacing gelang, lalat buah, tikus, dan lainnya. Mengembangkan teknologi laboratorium baru seperti sequencer otomatisberkekuatan tinggi dan teknologi komputasi, serta basis data informasi genom yangtersedia luas, yang dapat digunakan untuk memajukan analisis dan pemahaman kamitentang struktur dan fungsi gen. Menyebarkan informasi genom di antara para ilmuwan dan masyarakat umum. Pertimbangkan masalah etika, hukum, dan sosial yang menyertai HGP danpenelitian Amerika Serikat, penelitian publik tentang HGP dikoordinasikan oleh PusatNasional Penelitian Genom Manusia, sebuah divisi dari NIH dan DOE. Proyek ini mendanaitujuh pusat sekuensing utama di Amerika Serikat. Seiring waktu, proyek ini tumbuh menjadiupaya internasional dengan kontribusi dari para ilmuwan di 18 negara. Pekerjaan itu terutamadilakukan oleh Konsorsium Urutan Genom Manusia Internasional, yang melibatkan ilmuwan yang bekerja di 20 pusat di enam negara Cina, Prancis, Jerman, Inggris,Jepang, dan Amerika Serikat. Anggaran yang diperkirakan untuk menyelesaikan genomadalah $ 3 miliar, biaya $ 1 per nukleotida. Didorong sebagian oleh persaingan dariperusahaan swasta dan pengembangan sekuens DNA otomatis-komputer seperti yangdijelaskan pada Gambar 12 dan bioinformatika, HGP ternyata merupakan proyek pemerintahyang langka yang menyelesaikan semua tujuan awal dan beberapa tambahan. tujuan lebihdari 2 tahun lebih cepat dari jadwal dan di bawah paling agresif dalam proyek ini adalah sebuah perusahaan swasta bernamaCelera Genomics dinamai dari kata Latin yang berarti "kecepatan" yang disutradarai olehDr. J. Craig Venter, yang merupakan ilmuwan yang mengarahkan Institute for GenomicResearch ketika menggunakan kloning senapan. untuk mengurutkan genom untuk sebagaimana dibahas sebelumnya pada bagian ini. Celera mengumumkan niatnya untuk menggunakan pendekatan sequencing shotgun novelnya, mirip dengan metode yangmereka miliki digunakan untuk mengurutkan genom untuk H. influenza, serta sekuenserDNA yang diautomasi tinggi dengan komputer yang baru dikembangkan, untuk mengurutkanseluruh genom manusia dalam 3 tahun. Khawatir bagaimana perusahaan swasta dapatmengendalikan pelepasan informasi genom, kelompok pemerintah AS yang terlibat dalamHGP secara efektif dipaksa untuk mengimbangi kelompok swasta agar tetap kompetitif dalamperlombaan untuk menyelesaikan genom. Pada tahun 1998, sebagai hasil dari kemajuan yang dipercepat, target tanggal revisitahun 2003 ditetapkan untuk penyelesaian proyek. Pada tanggal 26 Juni 2000, para pemimpinHGP dan Celera Genomics berpartisipasi dalam konferensi pers dengan Presiden Bill Clintonuntuk mengumumkan bahwa "rancangan kerja" kasar sekitar 95% dari genom manusia telahdikumpulkan hampir 4 tahun lebih awal dari yang awalnya jadwal waktu yangdiproyeksikan. Pada konferensi pers bersama pada tanggal 12 Februari 2001, Dr. FrancisCollins, direktur Institut Riset Genom Manusia Nasional NIH dan HGP, dan Dr. J. CraigVenter dari Celera mengumumkan bahwa serangkaian makalah yang menjelaskan analisisawal dari urutan kerja draft genom diterbitkan oleh kelompok penelitian mereka di jurnalbergengsi Nature dan Science, masing-masing. Para ilmuwan menghabiskan 2 tahunberikutnya bekerja untuk mengisi ribuan celah dalam genom dengan menyelesaikan urutanpotongan-potongan yang belum selesai, mengoreksi potongan-potongan yang tidak selaras,dan membandingkan urutan untuk memastikan keakuratan genom. Pada 14 April 2003,Konsorsium Pengurutan Genom Manusia Internasional mengumumkan bahwa pekerjaannyatelah selesai. "Peta" genom manusia pada dasarnya lengkap, dengan hampir semua basisdiidentifikasi dan ditempatkan dalam urutan yang tepat dan gen potensial yang ditugaskanuntuk kromosom lihat Gambar 22. ChromosomeGambar22. Perkiraan jumlah gen pada setiap kromosom dan ukuran perkiraan dalam pasanganbasa bp dari masing-masing kromosom gambar-kompilasi untuk kromosom manusia didasarkan pada informasigenom manusia Sanger Institute di database Vertebrate Genome Annotation VEGA.Jumlah gen adalah perkiraan, karena sebagian didasarkan pada prediksi gen, itulahsebabnya nilai ini lebih tinggi dari perkiraan gen yang secara umum diterimasebagai jumlah gen manusia. Total panjang kromosom juga merupakan perkiraan,berdasarkan pada ukuran perkiraan dari beberapa bagian nonkoding genom yang tetaptidak diikutkan. Atas perkenan Mikael Häggström. Gambar 23. Usulan Fungsi untuk Jumlah Gen Manusia yang Ditugaskan ke Berbagai Kategori FungsionalTanda kurung menunjukkan persentase berdasarkan data yang diterbitkan tahun 2001 olehVenter et al. untuk bases Berikut ini adalah ringkasan sorotan penting dari beberapa konsep dasar yang telah dipelajaripara ilmuwan dari HGP Genom manusia terdiri dari kurang lebih 3,1 miliar pasangan basa. Genomnya sekitar 99,9% sama antara individu-individu dari semua kebangsaan. Polimorfisme nukleotida tunggal SNP dan variasi jumlah salinan CNV sepertipenghapusan panjang, penyisipan dan duplikasi dalam genom-akun untuk banyakkeragaman genom yang diidentifikasi antara manusia. Kurang dari 2% dari kode genom untuk gen. Sebagian besar DNA kita adalah pengkodean non-protein, dan urutan DNAberulang setidaknya 50% dari DNA bukan pengkodean. Genom mengandung sekitar gen penyandi protein. Banyak gen manusia yang mampu membuat lebih dari satu protein, yangmemungkinkan sel-sel manusia membuat setidaknya protein hanya darisekitar gen. Fungsi lebih dari setengah dari semua gen manusia tidak diketahui. Kromosom 1 mengandung jumlah gen tertinggi. Kromosom Y berisi gen yangpaling sedikit. Banyak gen dalam genom manusia menunjukkan tingkat kemiripan urutan yangtinggi dengan gen pada organisme lain. Ribuan gen penyakit manusia telah diidentifikasi dan dipetakan ke kita mendapat manfaat dari HGP? Urutan lengkap genom manusia telahdigambarkan sebagai "cetak biru" genetik manusia, yang mengandung kunci ilmiah untukmemahami biologi dan perilaku kita. Mengidentifikasi semua gen manusia tidak sepentingmemahami apa yang dilakukan gen-gen ini dan bagaimana fungsinya. Kami tidak akansepenuhnya memahami fungsi semua gen manusia selama bertahun-tahun, jika pernah. Salahsatu dampak langsung dari HGP adalah identifikasi gen yang terkait dengan penyakit genetikmanusia. Kami akan membahas beberapa cara HGP mengubah diagnosis dan pengobatanpenyakit genetik. Pemahaman yang lebih baik tentang dasar genetik dari banyak penyakitakan mengarah pada pengembangan strategi baru untuk deteksi penyakit dan terapi danpenyembuhan inovatif. Untuk informasi terbaru tentang HGP dan untuk ikhtisar yang luar biasa dari tujuan, teknologi sekuensing dan pemetaan, dan masalah etika, hukum, dan sosialdari HGP, kunjungi situs genom manusia yang terdaftar di Situs Web Genom Manusia Memulai Revolusi “Omics”HGP dan genomik sebagian besar bertanggung jawab untuk mengantarkan pada areabaru penelitian biologi - "omics." Tampaknya setiap tahun, area baru atau yang sudah adadalam riset biologi digambarkan memiliki koneksi omics. Sebagai contoh Proteomik, mempelajari semua protein dalam sel Metabolomik, mempelajari protein dan jalur enzimatik yang terlibat dalammetabolisme sel Metabonomi, mengukur produk metabolisme yang diproduksi oleh sel sebagairespons terhadap rangsangan seperti pengobatan dan manipulasi genetik Glycomics, mempelajari karbohidrat sel Transkriptomik, mempelajari semua gen yang diekspresikan Transkripsi dalamsel Metagenomik, analisis genom organisme yang dikumpulkan dari lingkungan Farmakogenomik, obat yang disesuaikan berdasarkan profil genetik seseoranguntuk kondisi tertentuJika ada area "omics" yang didefinisikan di sini yang menarik bagi Anda, lakukanriset Internet tentang topik ini dan Anda akan menemukan banyak sekali informasi tentangmasing-masing area. Kami akan menyentuh banyak area omics ini di seluruh teks. Sebagaibukti lebih lanjut dari dampak genomik, bidang baru ilmu gizi, yang disebut genomik giziatau nutrigenomik, telah muncul. Nutrigenomics difokuskan pada pemahaman interaksiantara diet dan gen. Beberapa perusahaan menyediakan tes nutrigenomik, menggunakanmicroarray atau tes genetik lainnya untuk menganalisis genotipe Anda untuk gen yang didugaterkait dengan berbagai kondisi medis atau aspek metabolisme nutrisi. Perusahaan-perusahaan ini kemudian memberikan laporan khusus tentang nutrisi dan mengklaim bahwamereka dapat menyarankan perubahan diet yang harus Anda lakukan untuk meningkatkankesehatan Anda dan mencegah penyakit berdasarkan gen Anda. Apakah nutrigenomik benar-benar merupakan pendekatan ilmiah yang valid adalah subjek perdebatan di antara parailmuwan. Genomik KomparatifMungkin mengejutkan Anda bahwa selain mempelajari genom manusia, HGPmelibatkan pemetaan dan sekuensing genom dari sejumlah organisme model, termasuk tanaman model yang disebut Arabidopsis thaliana, ragi Saccharomyces cerevisiae, lalatbuah Drosophila melanogaster, cacing gelang nematoda elegans Caenorhabditis, dan tikusMus musculus, di antara spesies lainnya. Urutan genom lengkap dari organisme model initelah sangat berguna untuk studi genomik komparatif, yang memungkinkan para penelitiuntuk mempelajari struktur dan fungsi gen dalam organisme ini dengan cara yang dirancanguntuk memahami struktur dan fungsi gen pada spesies lain, termasuk manusia. Karena kitamemiliki banyak gen yang sama seperti lalat, cacing gelang, dan tikus, penelitian semacamitu juga akan mengarah pada pemahaman yang lebih besar tentang evolusi manusia. Jumlahgen yang kami bagikan dengan spesies lain sangat tinggi, mulai dari sekitar 30% gen dalamragi hingga sekitar 80% gen pada tikus dan sekitar 95% gen pada simpanse Tabel 3.Analisis genom komparatif genom untuk "sahabat pria" telah mengungkapkan bahwakami berbagi sekitar 75% dari gen kami dengan anjing. DNA manusia bahkan mengandungsekitar 100 gen yang juga ada dalam banyak bakteri. Ketika para peneliti menyelesaikan 814juta-bp genom landak laut Strongylocentrus purpuratus, suatu invertebrata yang telahberfungsi sebagai model organisme penting terutama untuk ahli biologi perkembangan, kamimengetahui bahwa dari gen dalam genom bulu babi, banyak gen dengan gen pentingfungsi pada dari banyak organisme model telah sepenuhnya diurutkan, dan ada ratusanproyek genomik yang sedang berlangsung di seluruh dunia. Para ilmuwan genom di seluruhdunia telah mengusulkan untuk mengurutkan genom vertebrata, rencana Genome10K. Rencana ambisius ini mengusulkan untuk mengumpulkan genom dalam 5 tahun,sekitar satu genom sehari. Genom pertama untuk pohon, kapas hitam sejenis poplar,diurutkan beberapa tahun yang lalu. Sampai saat ini, gen poplar adalah jumlahtertinggi yang ditemukan dalam genom. Para ilmuwan mengantisipasi menggunakan data dariproyek ini untuk membantu industri kehutanan membuat produk yang lebih baik, termasuk biofuel atau bahkan poplar yang direkayasa secara genetika untuk menangkap karbondioksida tingkat tinggi dari atmosfer. Genom lebah madu juga telah selesai, dan informasidari proyek ini akan digunakan untuk memahami genetika lebah dan perilaku untukmembantu industri penghasil madu serta memajukan pemahaman tentang bagaimana racunlebah menghasilkan respons akan membahas proyek genomik dalam bab-bab lain dari teks ini, dansepanjang itu Anda akan belajar tentang banyak aplikasi genomik. Sebagai contoh, proyeksekuensing genom mikroba adalah sekuensing genom untuk ratusan mikroba yang barudiidentifikasi, termasuk mikroba yang hidup dan pada manusia Proyek MicrobiomeManusia dan mikroba hadir dalam sampel air, tanah, dan udara dari seluruh duniametagenomics. Pendekatan genetika genetik dirancang untuk menciptakan bentukkehidupan baru dari genom yang dibangun secara Zaman BatuSebagai contoh genomik yang menarik lainnya, sejumlah laboratorium di seluruhdunia terlibat dalam menganalisis DNA "kuno". Studi-studi ini menghasilkan data menarikdari sejumlah kecil DNA purba dari tulang dan jaringan lain serta sampel fosil yang berusiapuluhan ribu tahun. Analisis DNA dari mumi, mammoth, platipus, beruang gua zamanPleistosen berumur tahun, dan Neanderthal adalah beberapa contoh genomik ZamanBatu yang paling menonjol, yang juga disebut peneliti dari McMaster University di Kanada dan Pennsylvania State Universitymenerbitkan data urutan parsial sekitar 13 juta bp dari mammoth berbulu berusia Studi ini menunjukkan bahwa ada sekitar 98,5% identitas urutan antara mammoth dangajah Afrika. Pekerjaan selanjutnya oleh ilmuwan lain telah menggunakan sekuensingseluruh genom senapan mitokondria dan DNA nuklir dari mammoth Siberia untukmemberikan data pada genom mammoth. Studi-studi ini menunjukkan bahwa genommammoth berbeda dari gajah Afrika hanya 0,6%. Studi-studi ini adalah demonstrasi besartentang bagaimana DNA stabil dapat berada di bawah kondisi yang tepat, terutama ketikadibekukan. Juga menarik adalah kesamaan yang telah terungkap antara mammoth dan genom manusia! Ketika sekuens gen dari kromosom manusia disejajarkan dengan sekuens darigenom mammoth, sekitar 50% gen mammoth menunjukkan keselarasan urutan dengan genmanusia pada tahun 2009, sebuah tim ilmuwan yang dipimpin oleh Svante Pääbo di InstitutMax Planck untuk Antropologi Evolusi di Jerman dan 454 Biologi melaporkan penyelesaianrancangan kasar genom Neanderthal Homo neanderthalensis yang mencakup lebih dari 3miliar bp DNA Neanderthal dan tentang dua pertiga dari genom. Pada tahun 2006, kelompokPääbo, bersama dengan sejumlah ilmuwan di Amerika Serikat, melaporkan urutan pertamasekitar bp DNA nuklir yang diisolasi dari tulang sampel Neanderthal berusia dari Kroasia. Karena Neanderthal adalah kerabat dekat manusia, pengurutan genomNeanderthal memberikan peluang luar biasa untuk menggunakan genomik komparatif untukmemajukan pemahaman kita tentang hubungan evolusi antara manusia dan Neanderthal 99% identik. Beberapa dari sekuens ini terlibatdalam perkembangan kognitif dan motilitas sperma. Dari banyak gen yang dimiliki olehspesies ini, FOXP2 adalah gen yang telah dikaitkan dengan kemampuan berbicara danbahasa. Ada banyak gen yang memengaruhi bicara, jadi temuan ini tidak berarti Neanderthalberbicara seperti kita. Tetapi karena Neanderthal memiliki gen FOXP2 manusia modern yangsama, para ilmuwan berspekulasi bahwa Neanderthal memiliki kemampuan bahwa manusia modern dan Neanderthal hidup dalam kisaran yang tumpangtindih tahun yang lalu telah menimbulkan spekulasi tentang interaksi antara manusiamodern dan Neanderthal. Studi genom menunjukkan bahwa ada kawin silang antaraNeanderthal dan manusia modern sekitar hingga tahun yang lalu diMediterania timur. Studi-studi yang menarik ini, yang sebelumnya dianggap mustahil,mengalami percabangan dalam banyak bidang evolusi manusia, dan memang akan menarikuntuk mengikuti kemajuan pekerjaan Tahun Setelah HGP Apa Selanjutnya?Dalam 10 tahun sejak selesainya rancangan urutan genom manusia, studi tentang genommanusia berlanjut dengan sangat cepat. Sebagai hasil dari HGP, banyak bidang tema utama lainnya untuk penelitian genom manusia telah muncul, termasuk proyek genom kanker,analisis epigenom termasuk Proyek Epigenom Manusia, yang membuat ratusan petaperubahan epigenetik dalam berbagai jenis sel dan jaringan dan mengevaluasi peranpotensial epigenetik dalam penyakit kompleks, karakterisasi SNP Proyek HapMapInternasional dan CNV untuk perannya dalam variasi genom, penyakit, dan aplikasifarmakogenomik. Ketika HGP sedang diselesaikan, sekelompok sekitar tiga lusin tim penelitidi seluruh dunia memulai Proyek Encyclopedia of DNA Elements ENCODE. Tujuan utamaENCODE adalah menggunakan pendekatan eksperimental dan bioinformatika untukmengidentifikasi dan menganalisis elemen fungsional seperti situs awal transkripsi,promotor, dan peningkat yang mengatur ekspresi gen manusia. Di sini kita membahas duabidang proyek penelitian terkait genom manusia proyek genom hasil personalisasi danproyek genom Genom yang DipersonalisasiKarena kemajuan pesat dalam teknologi pengurutan, beberapa perusahaan bahkantelah mengusulkan untuk mengurutkan genom untuk orang-orang individu, atau genomikhasil personalisasi. Pada tahun 2006, Yayasan X Prize mengumumkan Archon X Prize forGenomics, sebuah proyek untuk memberikan $ 10 juta kepada kelompok pertama untukmengembangkan teknologi yang mampu mengurutkan 100 gen manusia dengan tingkatakurasi tinggi dalam 10 hari dengan harga di bawah $ per genom. Grup lain sedangmengerjakan pengurutan genom hasil personalisasi hanya dengan $ Mengejar genom $ adalah bukti bahwa sekuensing DNA pada akhirnya mungkin cukup terjangkau bagiindividu untuk mempertimbangkan memperoleh pembacaan cetak biru genetik 2007, 454 perusahaan Life Sciences bersama dengan para peneliti di BaylorUniversity mengurutkan genom James Watson sekitar $ 1 juta. 454 Life Sciencesmemutuskan bahwa "Project Jim," mengurutkan genom pembuat kode dari struktur DNA,adalah cara profil tinggi yang baik untuk mengembangkan dan mempromosikan teknologisequencing generasi baru mereka. James Watson memberi 454 ilmuwan sampel darah pada 2005 dan, pada pertengahan 2007, mereka memberi Dr. Watson dua DVD berisi urutangenomnya, yang diselesaikan dengan biaya kasar hanya di bawah $ 1 juta. Watson telahmengizinkan urutannya tersedia bagi para peneliti kecuali untuk urutan gen apolipoprotein E-nya ApoE. Mutasi gen ApoE dapat menunjukkan disposisi untuk penyakit genom manusia, Craig Venter, juga membuat genomnya diurutkan oleh para ilmuwandi The Craig J. Venter Institute. George Church dan rekan-rekannya di Universitas Harvardtelah memulai Proyek Genom Pribadi PGP dan telah merekrut sukarelawan untukmenyediakan DNA untuk sekuensing genom individu dengan memahami bahwa data genomyang dihasilkan akan tersedia untuk umum. Genom Gereja telah selesai dan tersedia secaraonline. Karena genom Watson dan Venter diselesaikan, urutan genom lengkap pertamadisediakan untuk manusia "kuno" individu, seorang Palaeo-Eskimo, yang diperoleh darirambut yang diawetkan dengan permafrost yang berumur sekitar tahun. Pekerjaan inipulih sekitar 78% dari genom diploid dan mengungkapkan banyak SNP yang menarik yangsekitar 7% belum pernah dilaporkan sebelumnya.Proyek Genom KankerKanker sebagai penyakit memiliki banyak komponen genetik. NIH mulai bekerjapada proyek genom kanker yang disebut Cancer Genome Atlas Project TCGA untukmemetakan gen penting dan perubahan genetik yang terlibat dalam kanker. Proyek TCGAtelah mengurutkan lebih dari 100 genom parsial untuk berbagai kanker hingga saat dengan sekelompok peneliti di 11 negara, yang disebut International CancerGenome Consortium JCGC, ada rencana untuk mengurutkan genom dari lebih dari 500sampel tumor yang mewakili lebih dari 20 kanker berbeda. Tidak mengherankan, kankeryang paling umum - seperti kanker payudara, paru-paru, usus besar, pankreas, otak, danovarium - adalah salah satu jenis kanker yang paling aktif dipelajari dan sedang dianalisisterlebih dahulu. Pada akhirnya diharapkan bahwa identifikasi gen kunci yang terlibat dalampembentukan tumor dan metastasis penyebaran akan mengarah pada peningkatan teknik diagnostik untuk mendeteksi kanker dan perawatan yang lebih efektif untuk MEMUTUSKANUntuk melakukan sequencing atau Tidak?Pada awal 2010, tiga belas sekuens genom manusia individu telah dilaporkan,termasuk sekuens untuk orang Yoruba Afrika, dua individu asal Eropa barat laut, seorangindividu Han Cina, dua orang dari Korea, Uskup Agung Afrika Desmond Tutu, sebuahkeluarga berempat, dan beberapa lainnya. Apakah Anda ingin genom Anda diurutkan? Apayang akan Anda bayar untuk urutan genom Anda? Apa yang akan Anda lakukan denganinformasi urutan ini? Siapa yang akan memiliki akses ke informasi urutan Anda? KarirPilihan Karir di Industri Biofarmasi Perspektif dari Lulusan BaruPerusahaan biofarmasi menemukan perawatan obat baru dan mengembangkannya daritahap penelitian dan pengembangan hingga manufaktur komersial, pemasaran, dan akhirnyapenjualan. Apa yang membuat industri biofarmasi atau "biofarma," berbeda dari industrifarmasi tradisional? Perusahaan farmasi pada umumnya mengembangkan senyawa obatberbasis kimia yang mengobati penyakit secara nonspesifik, sedangkan biofarmamenggunakan pengetahuan sistem biologis untuk mengembangkan senyawa obat turunanbiologis yang mengobati penyakit dengan cara yang sangat spesifik. Meskipun biofarma saatini jauh lebih kecil daripada industri farmasi, pertumbuhannya dipicu oleh meningkatnyakesadaran akan potensi untuk mengobati penyakit secara efektif dan mungkin menemukanobat untuk penyakit yang sebelumnya dianggap tidak dapat disembuhkan. Garis-garis antaraperusahaan farmasi tradisional dan biofarma kabur. Banyak perusahaan farmasi besarmemiliki divisi bioteknologi yang bekerja pada biofarma. Misalnya, perusahaan farmasiRoche baru-baru ini membeli karir dalam industri biofarmasi serupa dengan yang ada di industri farmasi,karena kesamaan dalam jalur pengembangan obat. Kemungkinan karier sangat beragam; Namun, mendapatkan pekerjaan dengan perusahaan biofarmasi tidaklah mudah. Persaingansangat ketat, dan kebenarannya adalah bahwa tidak peduli seberapa baik seseorang cocokdengan suatu posisi, selalu ada orang lain yang akan sama berkualitasnya. Karena itu,mulailah memikirkan opsi karier tak lama setelah Anda memilih jurusan. Cara terbaik untukmemulai adalah dengan membiasakan diri dengan industri. Banyak situs web yang dikutip diSitus Web Pendamping, adalah sumber yang bagus untuk mempelajari berbagai peluangkerja. Pengetahuan ini akan memungkinkan Anda untuk menyesuaikan pendidikan Andauntuk lebih melayani fungsi pekerjaan tertentu, cara yang pasti untuk maju dari posisi tingkat pemula tersedia bagi mereka yang bergelar associate dansarjana; namun, memiliki gelar sarjana akan menjamin gaji awal yang sedikit lebih posisi entry-level yang membayar lebih tinggi memerlukan gelar lanjutan, sepertigelar master atau bahkan gelar doktor PhD.. Mengetahui hal ini dapat sangat memengaruhikeputusan Anda untuk melanjutkan pendidikan sebelum memasuki dunia kerja. Namun, samapentingnya dengan pelatihan pendidikan, pengusaha terus mencari individu yangberpengalaman. Mendapatkan pengalaman kehidupan nyata melalui kerja sukarela, penelitianstudi independen, atau magang dapat menawarkan Anda kesempatan terbaik untukmengeksplorasi pilihan Anda saat Anda menyelesaikan studi. Magang industri adalah caraterbaik untuk belajar tentang berbagai peran dalam perusahaan dan untuk melihat apa yangAnda sukai, dan mereka juga dapat mengarah ke pekerjaan setelah Anda tidak dapat menemukan pekerjaan yang ideal di industri setelah lulus,pekerjaan sementara adalah cara lain yang baik untuk memulai dengan perusahaanbiofarmasi. Banyak layanan penempatan bekerja dengan pencari kerja dan perusahaanbioteknologi untuk menemukan orang-orang yang dapat memenuhi kebutuhan dalam waktusingkat; namun, jika Anda melakukan pekerjaan dengan baik di posisi sementara, perusahaandapat mencoba mencari posisi permanen untuk mempertimbangkan suatu posisi, penting untuk memahami uraian pekerjaanserta apa yang diperlukan dari posisi itu. Banyak perusahaan mempekerjakan orang sebagaiteknisi lab, tetapi deskripsi pekerjaan untuk posisi ini sama banyaknya dengan pekerjaan. Misalnya, teknisi laboratorium kendali mutu mengikuti prosedur yang sangat terkontrol dansangat tepat untuk menguji kualitas suatu produk; fungsi utama mereka adalah untukmemastikan bahwa produk yang baik sedang diproduksi. Teknisi yang bekerja dalamkapasitas diagnostik bertanggung jawab untuk menguji produk atau prosedur baru untukmemastikan itu berfungsi dengan benar dan kemudian merekomendasikan perbaikan. Teknisiriset dan pengembangan atau penemuan bertanggung jawab atas hal itu fungsi utamanyaadalah untuk mengembangkan produk baru serta untuk menemukan kegunaan baru untukproduk lama. Anda tidak perlu memiliki pengalaman sebelumnya dalam setiap pengujianeksperimental atau prosedur lab untuk menjadi teknisi lab. Perusahaan yang baik akan selalumengajari Anda apa yang perlu Anda ketahui untuk melakukan pekerjaan tertentu; namun,semua teknisi lab harus memiliki keterampilan lab yang baik dan terorganisir, berorientasipada detail, termotivasi, dan, yang paling penting, negatif potensial dari bekerja di industri biofarmasi adalah bahwa semuapekerjaan dirancang untuk mengembangkan, memproduksi, dan menjual suatu dan orisinalitas tidak selalu dimasukkan ke dalam rutinitas kehidupan sehari-haridi laboratorium. Lingkungan kerja biasanya sangat terkontrol karena semua operasi diaturoleh FDA dan harus didokumentasikan dengan ketat. Juga, karena produk diproduksi melaluiproses biologis, jadwal kerja terkait langsung dengan proses ini, seperti menunggu seltumbuh dengan kepadatan yang tepat. Dalam beberapa kasus, ini bisa berarti minggu kerjayang lebih pendek atau jam kerja yang kurang industri biofarmasi, lingkungan kerja yang serba cepat selalu berubah danselalu menuntut agar karyawannya bekerja keras dan efisien. Setiap hari membawa hambatandan tantangan baru, yang membuat bekerja di industri ini sangat menarik Disumbangkanoleh Robert Sexton Biologi, Monmouth University, Operasi PengembanganOnkologi, Novartis Pharmaceuticals Corporation.MEMBUAT PERBEDAANSalah satu contoh paling sukses tentang bagaimana teknologi DNA rekombinanmenyelamatkan hidup juga merupakan salah satu aplikasi pertamanya untuk mengobati penyakit manusia. Sebelumnya dalam bab ini kita membahas bagaimana bentuk insulinrekombinan, yang disebut Humulin, menjadi produk pertama dari teknologi DNArekombinan yang disetujui oleh FDA untuk digunakan pada manusia. Sebelum insulinrekombinan, insulin diisolasi dari hewan. Pada banyak penderita diabetes, insulin dari sumberhewani tidak efektif dan menyebabkan berbagai komplikasi. Memproduksi insulinrekombinan tidaklah mudah. Insulin terdiri dari dua rantai polipeptida yang berbeda. Keduapolipeptida harus diekspresikan dalam bentuk rekombinan dan disusun untuk membentukhormon aktif. Tak perlu dikatakan, itu adalah suatu prestasi untuk berhasil merekayasainsulin, protein rekombinan yang menantang, sebagai produk pertama dari teknologi ini. Inimenunjukkan bahwa pendekatan rekombinan untuk menghasilkan protein kompleksdimungkinkan membuat para ilmuwan sangat optimis tentang kemungkinan pendekatan DNArekombinan untuk membuat protein lain dari nilai terapeutik. Humulin pada awalnyadikembangkan oleh Genentech dan kemudian didistribusikan secara luas oleh Eli Lilly andCompany, yang terus memproduksi Humulin hingga saat ini. Sejak pertama kali tersedia padatahun 1982, Humulin telah digunakan dengan sukses dan aman untuk merawat jutaan besar insulin yang diberikan kepada pasien diabetes mellitus yang tergantunginsulin di seluruh dunia adalah insulin rekombinan. Sekarang ada banyak variasi Humulinyang tersedia, sebagian besar adalah campuran yang berbeda yang menentukan apakahinsulin bekerja cepat atau lambat setelah disuntikkan. Baru-baru ini para peneliti telah bekerjapada teknik untuk menghasilkan insulin rekombinan pada tanaman, yang diharapkan dapatsecara dramatis mengurangi biaya pembuatan bioman. Kisah insulin adalah contoh luar biasatentang bagaimana teknik DNA rekombinan digunakan untuk membuat perbedaan dalammengurangi rasa sakit dan penderitaan & AKTIVITASJawaban dapat ditemukan di akhir bab Bedakan di antara kloning gen, teknologi DNA rekombinan, dan rekayasa genetika denganmenjelaskan setiap proses dan membahas bagaimana mereka saling terkait. Berikan contohmasing-masing pendekatan seperti yang dijelaskan dalam bab ini. 2. Jelaskan pentingnya DNA ligase dalam percobaan DNA rekombinan. Apa yang dilakukanenzim ini dan bagaimana aksinya berbeda dari fungsi enzim restriksi?3. Laboratorium Anda baru saja menentukan urutan gen tikus yang diduga terlibat dalammengendalikan kemampuan pembuahan sperma tikus. Anda percaya gen yang sama dapatmengendalikan kesuburan pada pria manusia. Jelaskan secara singkat bagaimana Anda bisamenggunakan apa yang Anda ketahui tentang gen tikus ini dikombinasikan dengan PCRuntuk mengkloning gen manusia pelengkap. Pastikan untuk menjelaskan pendekataneksperimental Anda dan materi laboratorium yang diperlukan. Juga jelaskan secara terperincisetiap prosedur yang diperlukan untuk mengonfirmasi bahwa Anda memiliki gen manusiayang sesuai dengan gen tikus Fitur-fitur vektor kloning plasmid apa yang membuatnya berguna untuk mengkloningDNA? Berikan contoh berbagai jenis vektor kloning dan diskusikan aplikasi mereka Jika Anda melakukan percobaan PCR dimulai dengan hanya satu salinan DNA beruntaiganda, kira-kira berapa banyak molekul yang akan dihasilkan setelah 15 siklus amplifikasi?6. Bandingkan dan kontras pustaka genom dengan pustaka cDNA. Jenis perpustakaan manayang akan menjadi pilihan pertama Anda untuk digunakan jika Anda mencoba untukmengkloning gen dalam sel-sel adipocyte lemak yang mengkode protein yang didugaterlibat dalam obesitas? Jelaskan jawabanmu. Apa jenis perpustakaan yang akan Anda pilihjika Anda tertarik dalam kloning gen reg dan klik tombol "Analisis urutan". Apa elemenulatory seperti promoter dan enhancer yang Anda temukan? Apakah urutan Anda dipotongoleh Bam HI? urutan? Analisis urutan ini untuk situs pemotongan lainnya jawab pertanyaanberikut. Apakah urutan ini7. Kunjungi Warisan Mendelian Online pada Manusia yang dipotong oleh Eco RI?Bagaimana dengan Sma I? 8. Apa yang terjadi jika Situs OMIM di Situs Web Sahabat dan Anda melakukan pencariandan pemindaian untuk memotong situs dengan semuanya lalu klik "Cari basis data OMIM."Ketikkan enzim di dalam basis data? diabetes di kotak pencarian dan kemudian klik "KirimCari. ”Apa yang Anda temukan? Coba ketikkan 114480 9. Pergi ke bagian biologi molekuler kotak pencarian Biologi. Apa yang terjadi kali ini? AlterProject situs web dari University of Arizona secara asli, cari gen Anda mungkin antar Anda dapat menemukan alamat pada pendamping ested di dan melihat apa yang dapat Andatemukan di OMIM. Jika Website. Tautan ke "Teknologi DNA Rekombinan hasil pencarianOMIM Anda terlalu teknis, ogy" dan uji pengetahuan Anda tentang rekombinan kunjungibagian "Gen & Penyakit" dari teknologi DNA NCBI dengan mengerjakan pertanyaan di situsdari Situs Web Companion kemudian mencari situs ini. Cari di Web untuk perusahaan Sciona, yang 8. Analisis perangkat lunak terhadap urutanDNA membuatnya memasarkan perangkat evaluasi DNA MyCellf agar lebih mudah bagi ahlibiologi molekuler untuk mempelajari gen nutrigenomik gen. Apakah Anda berpikir kit sepertistruktur ini. Kegiatan ini dirancang untuk membantu Anda digunakan, meskipun sebagianbesar mereka mengalami aplikasi perangkat lunak analisis DNA. berdasarkan informasi yangtidak terbukti? Bayangkan urutan yang sangat singkat berikut ini11. Apa perbedaan struktural antara nukleotida, GGATCCGGCCGGAATT CGTA,deoxyribonucleotide dNTP dan sebuah dideoxyribo mewakili satu untai gen penting yangdigunakan nukleotida ddNTP untuk sekuensing DNA? baru saja dikirimkan kepada Andauntuk proyek penelitian Anda. Sebelum Anda dapat melanjutkan penelitian Anda, Anda harus 12. Menjelaskan beberapa temuan Human Genome untuk mengetahui enzim restriksi mana,jika ada, yang memotong Proyek ini. sepotong Biologi modern mengalami revo "omics" Pergi ke situs Webcutter dari Lutionpendamping. Apa artinya ini?Situs web. Gulir ke bawah halaman sampai Anda melihat kotak teks dengan judul, "Tempelurutan DNA ke dalam kotak di bawah ini." Ketikkan urutan potongan DNA Anda ke dalamkotak ini. Gulir ke bawah halaman, biarkan semua parameter pada pengaturan standarnyasampai Anda Kunjungi lihat “Silakan TunjukkanEnzim Yang Akan Disertakan Untuk mengunduh tujuan pembelajaran, ringkasan bab, dalamAnalisis.” Klik “Hanya yang berikut ini“. Mempertahankan Arus ”tautan web, glosarium,kartu flash, dan enzim” dan kemudian gunakan menu drop-down jpeg angka dari bab pilih Bam HI. Gulir ke bagian bawah atas Pertanyaan & Aktivitas1. Kloning gen adalah penyalinan kloning suatu gen atau sepotong gen. Istilah teknologiDNA rekombinan dan rekayasa genetika sering digunakan secara bergantian. Secara teknis, teknologi DNA rekombinan melibatkan penggabungan DNA dari sumber yang berbeda,sedangkan rekayasa genetika melibatkan memanipulasi atau mengubah komposisi genetiksuatu organisme. Sebagai contoh, mengikat sepotong DNA manusia ke dalam kromosombakteri adalah contoh teknologi DNA rekombinan, dan menempatkan potongan DNArekombinan ini ke dalam sel bakteri untuk membuat bakteri dianggap sebagai DNA ligase digunakan untuk membentuk ikatan fosfodiester antara fragmen DNA selamapercobaan DNA rekombinan. Ini adalah langkah penting dalam percobaan kloning karenaikatan hidrogen antara ujung lengket fragmen DNA tidak cukup kuat untuk menahan molekulDNA rekombinan bersama secara permanen. Enzim restriksi memotong DNA pada sekuensnukleotida tertentu sekuens pengenalan. DNA yang sering dicerna menjadi fragmen denganenzim restriksi sebagai langkah penting dalam banyak percobaan kloning sebelummenggunakan DNA ligase untuk menggabungkan Urutan gen yang dikloning dari tikus dapat digunakan untuk membuat primer yang dapatdigunakan untuk memperkuat DNA dari sel manusia dalam upaya untuk memperkuat genkomplementer pada manusia. Jika seseorang berhasil mendapatkan produk PCR daripercobaan ini, produk PCR dapat diurutkan dan dibandingkan dengan gen tikus untukmencari urutan nukleotida yang serupa menunjukkan bahwa gen ini terkait. Juga, produk-produk PCR dapat digunakan sebagai probe dalam percobaan penyaringan perpustakaanuntuk menemukan gen manusia fulllength atau sebagai probe untuk analisis Northern blotuntuk menentukan apakah mRNA untuk gen ini diekspresikan dalam jaringan Lihat Bagian Sekitar 2 n-1, di mana n = jumlah siklus.6. Pustaka genomik mengandung intron dan ekson, sedangkan pustaka cDNA berisi salinanmRNA yang ditranskripsikan secara DNA yang diekspresikan dalam jaringan cDNA adalah perpustakaan pilihan ketika gen yang diekspresikan sedangdikloning. Dalam mencari gen yang terlibat dalam obesitas, seseorang dapat membuat danmenyaring perpustakaan cDNA dari adiposit. Daerah pengaturan gen kloning, misalnya, urutan promoter dan enhancer dapat dicapai dengan perpustakaan DNA genom karenamengandung baik ekson dan Pencarian untuk diabetes mengungkapkan daftar urutan gen yang berhubungan dengandiabetes mellitus yang tergantung insulin dan tidak tergantung. Mengklik salah satu tautanbernomor yang disorot akan membawa Anda ke halaman informatif yang memberikanperincian besar tentang setiap gen. Pencarian dengan nomor tambahan 114480mengungkapkan informasi tentang gen untuk kanker payudara Potongan DNA ini dapat dipotong satu kali oleh Bam HI di awal urutan dan satu kali olehEco RI di akhir urutan. Tidak ada situs pemotongan untuk Sma I dalam urutan ini. Pencarianuntuk semua enzim dalam database mengungkapkan sekitar 50 enzim restriksi yang dapatmemotong urutan ini. Demonstrasi ini harus memberi Anda apresiasi tentang betapa kuatnyaprogram komputer untuk membantu ahli biologi molekuler menganalisis sekuens Jawaban yang diperbaiki tersedia di situs web saat siswa mengerjakan Terbuka berakhir; variabel DdNTP kehilangan oksigen pada karbon 3 '.12. Genom manusia terdiri dari sekitar 3,1 miliar pasangan basa. Genom ini sekitar 99,9%sama antara individu dari semua kebangsaan dan latar belakang. Kurang dari 2% kode genommanusia untuk gen. Sebagian besar DNA kami adalah pengkodean non-protein. Genommengandung sekitar hingga gen penyandi protein. Banyak gen manusia yangmampu menghasilkan lebih dari satu protein. Kromosom 1 mengandung jumlah gen Y berisi paling Revolusi "omics" biologi modern mengacu pada ekspansi cepat dari disiplin barupenelitian yang dihasilkan dari studi genomik, sebagaimana tercermin oleh istilah barumenggunakan omics akhiran atau ome. Secara umum penelitian semacam itu melibatkananalisis komprehensif berskala besar. Sebagai contoh, proteomik melibatkan studi tentangsemua protein dalam sel atau jaringan; Metabolomik melibatkan studi tentang semua proteindan produk metabolisme yang terlibat dalam proses metabolisme, seperti metabolismekarbohidrat gula. ResearchGate has not been able to resolve any citations for this has not been able to resolve any references for this publication.
Padasekitar tahun 1857 hingga 1876 seorang peneliti bernama Louis Pasteur melakukan penelitian tentang fermentasi dengan bantuan mikroorganisme. Fermentasi Rekayasa genetik dilakukan dengan cara yang disebut teknik rekombinan DNA. Teknik ini dilakukan di laboratorium dengan menggunakan peralatan yang
Pengertian Rekombinasi DNA Rekombinasi DNA rDNA adalah suatu upaya meletakkan DNA dari suatu organisme kedalam DNA bakteri dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang biasanya tidak akan terjadi bersama-sama melalui penyambungan gen. Dalam hal modifikasi genetik, itu diciptakan melalui pengenalan yang relevan DNA ke dalam DNA organisme yang ada seperti plasmid dan bakteri, untuk kode atau mengubah ciri yang berbeda dengan tujuan tertentu seperti resistensi antibiotik. Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui dalam sel, tetapi di rekayasa. Sebuah protein rekombinan adalah suatu protein yang dihasilkan dari DNA rekombinan. Yang salah satu penggunaan pertama DNA rekombinan dalam botani, banyak tanaman yang memiliki genom cukup beradaptasi yang sehingga memungkinkan bagi mereka untuk siap menggabungkan DNA dari spesies yang jauh terkait. Dengan splicing gen baru, para ilmuwan telah mampu mengembangkan tanaman yang tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim termasuk kekeringan dan panas. Dalam hal ini juga memungkinkan menggunakan DNA rekombinan untuk mengambil gen dari hewan tertentu dan sambatan dalam genom ada beberapa tanaman untuk membuat tanaman yang mengandung bahan kimia yang membuat mereka tidak menimbulkan selera berbagai hama dan parasit. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Replikasi DNA Semikonservatif – Pengertian, Komponen, Model, Dispersif, Para Ahli Sejarah Rekombinasi DNA Teknik DNA rekombinan pertama kali di usulkan oleh Peter Lobban, seorang mahasiswa pasca sarjana. Eksploitasi teknologi DNA rekombinan di fasilitasi oleh isolasi, penemuan dan penerapan endonuklease restriksi oleh Werner Arber, Daniel Nathans, dan Hamilton Smith, yang mereka terima tahun 1978 dalam penghargaan nobel dalam kedokteran. Sebuah terobosan dalam penerapan teknologi DNA rekombinan terjadi pada tahun 1977 ketika Herbert Boyer di produksi biosintetik manusia insulin di laboratorium. Urutan gen tertentu atau polinukleotida yang mengkode untuk insulin produksi pada manusia diperkenalkan ke koloni sampel yang bakteri. Ini adalah obat pertama kali dibuat melalui teknologi DNA rekombinan untuk disetujui oleh FDA dn komersial tersedia dibawah nama merek humulin. Sebagian besar insulin saat ini digunakan diseluruh dunia sekarang biosintetik rekombinan manusia insulin atau analognya. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Ciri-Ciri Bakteri Mycoplasma Dalam Biologi Proses Metode Rekombinasi DNA Metode yang digunakan dalam rekombinasi DNA, diantaranya adalah sebagai berikut Metode Transformasi DNA Merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Metode transformasi ini pertama kali dikembangkan untuk memindahkan sifat-sifat genetika yang membawa kenyataan bahwa DNA adalah bahan genetika. Meskipun transformasi telah dieksploitasi untuk mempelajari pautan gen pada berbagai organisme, metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid-plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya. Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel. Bila molekul DNA yang masuk berupa plasmid, maka replikasi plasmid dapat dimungkinkan dengan genom inang yang baru selama transformasi. Butuh 3 elemen kunci dari metode transformasi Inang yang bersifat stabil Membutuhkan vector untuk mereplkasikan sendiri Membutuhkan seleksi dari sel inang yang bias di inersikan dengan gen yang bisa disisipkan Metode Transduksi DNA Merupakan suatu proses tranfeksi gen dengan menyisipkan fage turunan dari bakterio fag lamda yang terdapat didalam virus atau hamper sama dengan proses transformasi Metode Konjugasi DNA Merupakan suatu metode untuk menyatukan gen asing kedalam DNA inang atau Bacterial Artificial Cromosom BAC. Dasar dari plasmid konjugasi adalah Merupakan bagian yang kecil dari episomal bacterial DNA yang memberikan suatu bakteri untuk mampu mengawali proses penyatuan dengan bakteri target. Batas klloning-nya = 75 – 300 kb. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Penyebab Mutasi Gen – Pengertian, Alam, Buatan, Faktor, Jenis, Mekanisme, Konsekunsi Teknologi DNA Rekombinan Pengertian Teknologi DNA Rekombinan, Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu Gambar Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menja di sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Pengertian DNA Beserta Fungsi, Struktur Dan Penggunaannya Dalam Teknologi Teknik DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi Teknik untuk mengisolasi DNA Teknik untuk memotong DNA Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA Teknuk untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA. Vektor,berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus. Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri. Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI pemotong plasmid/ADN dan enzim Ligase penyambung ptongan-potongan ADN Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Perbedaan Koenzim Dan Kofaktor Dalam Biologi Tahapan Rekombinasi DNA Teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa teknik diantaranya adalah teknik mengisolasi DNA, memotong DNA, menggabung/ menyambung DNA serta teknik memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan. Adapun langkah – langkah pembuatan DNA rekombinan menurut Moeljopawiro adalah sebagai berikut 1. Isolasi sumber DNA Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung fragment tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat. 2. Pemotongan Gen Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA pada situs spesifik. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata blunt end dan ujung kohesif sticky end. Ujung rata blunt end dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif sticky end dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas 5’ atau 3’ menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut “sticky” mudah lengket atau kohesif. 3. Penggabungan Gen Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes YAC, Bacterial Artificial Chromosomes BAC, Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors Barnum, 2005. Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung tidak rata sticky end, karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata blunt end dapat disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata. Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata Suharsono, 2000. 4. Penyisipan Gen ke dalam Bakteri Penyisipan gen dapat dilakukan melalui dua cara yaitu Konjugasi perpindahan DNA dari satu sel sel donor ke dalam sel bakteri lainnya sel resipien melalui kontak fisik antara kedua sel Transformasi pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. Transduksi cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantara fage. DNA yang masuk ke dalam bakteri dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. Adapun proses rekombinasi DNA dari pemotongan hingga penggabungan seperti yang ditampilkan pada gambar berikut 5. Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target / Sel Hidup dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu Transformasi pengambilan DNA rekombinan dari lingkungan di sekelilingnya. DNA-packaging memasukkan molekul DNA-phage ke dalam partikel phage. Minkroinjection memakai jarum super kecil untuk menginjekasikan DNA rekombinan langsung ke inti sel yang ditransformasi. Adapun proses pemasukan DNA rekombinan ke dalam sel target, misalnya pada tumbuhan dapat ditampilkan seperti gambar berikut Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Sel Tumbuhan Jenis, Bagian, Gambar Dan Fungsinya Lengkap Aplikasi dan Manfaat DNA Rekombinan Teknologi rekombinan DNA banyak diaplikasikan dalam kehidupan sehari-hari baik dalam bidang kesehatan, pertanian, kelautan, hukum dan ilmu pengetahuan. Berikut adalah contoh aplikasi dan manfaat teknologi rekombinan DNA pada bebrapa bidang kehidupan Bidang Kesehatan a. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. b . Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan dalam skala industri c. Hormon tumbuh manusia GH diproduksi menggunakan dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan misal cebol. d . Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit- penyakit keturunan genetic disorders dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen misal kanker Bidang Pertanian a. Bakteri Ice- ice minus bakteri yang telah direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu rendah. Digunakan disemprotkan pada tanaman agar tanaman tidak membeku di musim dingin. b. mikroba pendegradasi limbah. c. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt d. Tanaman tahan herbisida. Bidang Kelautan penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkan ukuran ikan Bidang Hukum a. Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari DNA misalnya kasus perkosaan b. Untuk menentukan keturunan dan keluarga berdasarkan DNA fingerprint. Bidang Ilmu Pengetahuan a. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia penyakit genetik misalnya kanker payudara b. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan konsorsium ilmuwan internasional untuk mewujudkan proyek genom manusia dan genom organisme lainnya. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Penjelasan Jenis Kromosom Berdasarkan Sentromer Lengkap Fungsi DNA Rekombinan Dalam pemberian vaksin melalui DNA rekombinan juga mungkin, dalam rangka untuk menciptakan vaksin ini, virus tuan rumah, seperti virus herpes, DNA-nya telah dihapus dan diisi dengan DNA rekombinan yang berisi coding untuk membuat antibodi untuk penyakit tertentu. Meskipun teknologi ini relatif baru, telah terbukti cukup berhasil dan ilmuwan berharap bahwa hal demikian bisa dikembangkan lebih lanjut untuk membuat vaksin untuk berbagai penyakit yang saat ini tidak memilikinya. Hal ini juga memungkinkan untuk menggunakan teknologi DNA rekombinan untuk menyembuhkan pasien dari beberapa penyakit. Ada banyak kondisi yang disebabkan oleh urutan DNA yang rusak yang dapat diganti dengan bagian yang sehat dari DNA yang diberikan kepada pasien, biasanya melalui pengiriman virus. Yang dalam penelitian menunjukkan bahwa penyakit seperti fibrosis kistik dan anemia sel sabit mungkin baik satu hari diobati dan dicegah melalui perubahan struktural untuk DNA seseorang. Teknologi untuk menyembuhkan penyakit ini masih dalam pengembangan, namun hasil awal yang cukup menjanjikan. Dalam pasien tidak memiliki urutan DNA yang membuat atau mengenali kebutuhan untuk enzim tertentu juga bisa mendapatkan keuntungan dari perawatan DNA rekombinan. Yang dalam kasus ini, sebuah untai DNA yang menciptakan protein khusus yang dibutuhkan untuk melakukan tugas tertentu dapat dimasukkan ke dalam DNA seseorang. Bagi banyak jenis kondisi, bagian yang rusak dari DNA tidak perlu diganti oleh DNA rekombinan, sebagai DNA baru hanya dapat ditempelkan ke untai normal. Bagi penderitan diabetes yang mengambil insulin memanfaatkan teknologi DNA rekombinan seperti ini karena insulin yang diproduksi dengan menggunakan jenis teknologi. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Escherichia Coli – Pengertian, Klasifikasi, Struktur, Faktor, Ciri, Diagnosis, Pengobatan Plasmid Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas diantara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi. Plasmid bias juga disebut substansi yang kecil bentuk sirkuler, merupakan ekstra kromosomal DNA molekul yang terdapat di dalam bakteri dan dapat mereplikasi dirinya sendiri diluar sel inang. Tingkat pertumbuhan dari plasmid tersebut, cepat dan batas kemampuannya untuk cloning adalah 0,1 – 10 kb. Plasmid yang hanya berisikan transgen berfungsi untuk mengawali proses penggabungan. Plasmid dapat dibedakan menjadi plasmid resisten, cold plasmid, plasmid degratif, dan plasmid virulen. Plasmid Resisten Yaitu plasmid yang hanya berisi gen dan hanya dapat mengakibatkan suatu resistensi dalam melawan zat anti biotika/racun. Cold Plasmid Yaitu plasmid yang berisi tentang gen yang berisi kode untuk menentukan produksi, misalnya colin, protein, yang dapat membunuh bakteri Plasmid Degratif Yaitu plasmid yang mampu memotong suatu substansi yang spesifik, misalnya touole, kelenjar saliva, dll. Plasmid Virulen. Yaitu plasmid yang terdapat didalam bakteri pathogen. contohnya dalam bakteria Salmonella, dapat menyebabkan penyakit. Mungkin Dibawah Ini yang Kamu Cari
TeknologiDNA Rekombinan " Definisi DNA Rekobinan, Peranan DNA Rekobinan, dan Dampak DNA Rekombinan BIOTEKNOLOGI
Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik penggabungan DNA dari spesies yang berbeda sehingga akan diperoleh organisme baru dengan sifat-sifat yang diinginkan. Pada pengembangan bioteknologi kelautan dan perikanan, teknik DNA rekombinan ini dapat digunakan antara lain untuk melakukan eksplorasi potensi dan biodiversitas organisme laut, seperti mikroba laut. Mikroba laut yang sebelumnya hanya merupakan kekayaan alam laut yang potensial dan belum memberikan nilai tambah, maka dengan teknologi DNA rekombinan dapat ditingkatkan nilai tambahnya untuk menghasilkan produk yang sangat prospektif. Secara garis besar, teknologi DNA rekombinan rekayasa genetika melibatkan penyisipan informasi genetik baru ke dalam organisme, biasanya bakteri, untuk memberikan kemampuan baru. Metode ini tidak mengikuti rangkaian prosedur yang pasti. Pemilihan metode bergantung kepada gen mana yang akan dipindahkan dan jenis organisme mana yang akan menerima informasi genetik baru. Pilihan tersebut bergantung pada sampai sejauh mana keterlibatan pilihan pribadi ilmuwan yang bersangkutan. To read the full-text of this research, you can request a copy directly from the author.... Bila melakukan suatu eksperimen kloning, maka ada lima komponen utama yang harus dipenuhi agar suatu eksperimen dapat berjalan dengan baik. Komponen-komponen yang harus dipenuhi tersebut adalah DNA donor insert, endonuklease restriksi, vektor, DNA ligase, dan sel inang host cell Noviendri, 2007. Beberapa keterampilan dasar yang diperlukan untuk melakukan kloning gen/DNA secara sederhana adalah preparasi sampel DNA murni, pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi, analisis ukuran fragmen DNA, penggabungan molekul DNA dengan enzim ligase, memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang cara yang paling umum adalah dengan cara transformasi, dan identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan hasil kloning Noviendri, 2007. ...... Komponen-komponen yang harus dipenuhi tersebut adalah DNA donor insert, endonuklease restriksi, vektor, DNA ligase, dan sel inang host cell Noviendri, 2007. Beberapa keterampilan dasar yang diperlukan untuk melakukan kloning gen/DNA secara sederhana adalah preparasi sampel DNA murni, pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi, analisis ukuran fragmen DNA, penggabungan molekul DNA dengan enzim ligase, memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang cara yang paling umum adalah dengan cara transformasi, dan identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan hasil kloning Noviendri, 2007. ...Transgenic plants are genetically modified plants made by inserting one or a number of genes from other organisms, with the aim of obtaining superior and desirable new traits, such as resistance to drought stress, resistance to pests, resistance to herbicides. So far, there are still many people who are worried about the safety of transgenic plants that have been successfully marketed. Therefore, we strive to provide information based on existing references to increase public understanding of GM crops. The educational materials provided consisted of an introduction to plant breeding techniques and the purpose of genetic transformation in plants, gene cloning techniques and the transformation of target genes into plant genomes to produce transgenic plants and molecular techniques used to select transgenic plants which were delivered in the form of online seminars. via zoom and live streaming on youtube. The flow of activities is divided into two stages, namely material presentation and discussion. This activity is expected to increase knowledge about assembling techniques for transgenic plants as an effort to educate the public regarding the safety of transgenic plants.... Bidang biologi molekuler dan medis saat ini memanfaatkan teknologi rekombinan untuk menghasilkan protein tertentu yang umumnya dibutuhkan dalam skala besar atau untuk mengefisienkan ekpresi suatu gen tertentu Langden et al., 2017 Melalui teknologi DNA rekombinan dapat ditingkatkan nilai tambah produk hasil rekombinan menjadi produk yang sangat prospektif Noviendri, 2007. ...Bioteknologi merupakan cabag ilmu Biologi yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup enzim, alkohol, antibiotik, asam organik dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa yang dapat digunakan oleh manuasia. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lainnya, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya, dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasaDesmond S. T. NichollIn this third edition of his popular undergraduate-level textbook, Des Nicholl recognises that a sound grasp of basic principles is vital in any introduction to genetic engineering. Therefore, the book retains its focus on the fundamental principles used in gene manipulation. It is divided into three sections Part I provides an introduction to the relevant basic molecular biology; Part II, the methods used to manipulate genes; and Part III, applications of the technology. There is a new chapter devoted to the emerging importance of bioinformatics as a distinct discipline. Other additional features include text boxes, which highlight important aspects of topics discussed, and chapter summaries, which include aims and learning outcomes. These, along with key word listings, concept maps and a glossary, will enable students to tailor their study to suit their own learning styles and ultimately gain a firm grasp of a subject that students traditionally find Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismGermany GreifswaldR DahuriFunctional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, Germany. Dahuri, R. 2003. Keanekaragaman Hayati Laut. PT Gramedia Pustaka Utama. 412 for The Engineering of marine bacterial exopolysaccharides. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismC Delbarre-LadratJ NoelJ RatiskolC SinquinM DionS C JouaultDelbarre-Ladrat, C., Noel. J., Ratiskol. J., Sinquin, C., Dion, M. and Jouault, S. C. 2006. Enzyme for The Engineering of marine bacterial exopolysaccharides. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, metagenomes for industrial applications. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismJ EckG MeurerR SchulzeP LorenzEck, J., Meurer. G., Schulze, R., and Lorenz, P. 2006. Accesing metagenomes for industrial applications. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, analysis of secondary metabolic gene clusters from marine sponge associated microbial consortia. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismL GrozdanovL FieselerJ PielU HentschelGrozdanov, L., Fieseler, L., Piel, J. and Hentschel, U. 2006. Metagenomic analysis of secondary metabolic gene clusters from marine sponge associated microbial consortia. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, Germany. Hala, Y. 1999. Penggunaan Gen Penanda Molekular untuk Deteksi Pelekatan dan Kolonisasi Vibrio harveyi pada Larva Udang Windu Penaeus monodon. Tesis Program Pascasarjana IPB, Bogor. 16 from genomes to enzymes. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismW LieblLiebl, W. 2006. Extremophiles from genomes to enzymes. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka W irausaha MudaMuladnoMuladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka W irausaha Muda, Bogor. 123 dan over ekspresi struktural dehalogenase dari Pseudomonas cepacia MBA4 pada E. coli. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi. Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi. LIPI. BogorU MurdiyatmoMurdiyatmo, U. 1992. Kloning dan over ekspresi struktural dehalogenase dari Pseudomonas cepacia MBA4 pada E. coli. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi. Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi. LIPI. Bogor. p. dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Poli-â-hidroksialkanoat PHA Sebagai Bahan Baku Plastik Biodegradabel dan Deteksi Gen Penyandi Enzim PHA SintaseD NoviendriNoviendri, D. 2004. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Poli-â-hidroksialkanoat PHA Sebagai Bahan Baku Plastik Biodegradabel dan Deteksi Gen Penyandi Enzim PHA Sintase. Tesis Program Pascasarjana. IPB. Bogor. 78 Suatu Revolusi Industri yang Baru. ErlanggaS PrentisPrentis, S. 1990. Bioteknologi Suatu Revolusi Industri yang Baru. Erlangga, Jakarta. 200 Gen Penisilin G As kartaD S SenoM IrahadikusumahSeno, D. S. H dan W irahadikusumah, M. 1992. Kloning Gen Penisilin G As karta. 279 and Problems of Molecular and Cell Biology. Schaum's outline seriesW D StanfieldJ S ColomeR J CanoStanfield, W. D., Colome, J. S. and Cano, R. J. 1997. Theory and Problems of Molecular and Cell Biology. Schaum's outline series. McGraw-Hill. StryerStryer, L. 2000. Biokimia. Ed 4. Vol. 3. Penerbit Buku Kedokteran, EGC. Jakarta. 279 ppPenuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen dan Pengurutan DNAS SuharsonoSuharsono, S. 2000. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen dan Pengurutan DNA. Pusat Antar Universitas IPB, Bogor. 100 gen protease Bacillus stearothermophillus DSM297 ke dalam Escherichia coli DH5 alfa dan telaah ekspresinyaM T SuhartonoK P ChandraA SuwantoI WuB Dan JunaidiSuhartono, M. T., Chandra, K. P., Suwanto, A., Wu, I. M dan Junaidi, B. 1995. Kloning gen protease Bacillus stearothermophillus DSM297 ke dalam Escherichia coli DH5 alfa dan telaah ekspresinya. Lap. Pen. Dikti-Dikbud. PAU-IPB, Bogor. 62 untuk menggali potensi mikroorganisme laut. Forum Bioteknologi Kelautan dan Perikanan IndonesiaA SuwantoSuwanto, A. 2004. Bioteknologi untuk menggali potensi mikroorganisme laut. Forum Bioteknologi Kelautan dan Perikanan Indonesia "Optimalisasi Pemanfaatan Sumberdaya Laut Melalui Pengembangan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan", Jakarta, 25 Maret aided test and selection for lycpene âcyclase inhibitors Molecular docking of Structurally diverse herbicidal Inhibitors in Dunaliella salina CCaP 19/18. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismH TofighiM R FazeliS MirzaeTofighi, H., Fazeli, M. R. and Mirzae, S. 2006. Computer aided test and selection for lycpene âcyclase inhibitors Molecular docking of Structurally diverse herbicidal Inhibitors in Dunaliella salina CCaP 19/18. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, penanda molekuler pada bakteri Molecular Marker Gene in BacteriaA T W AhyudiW ahyudi, A. T. 1997. Gen penanda molekuler pada bakteri Molecular Marker Gene in Bacteria. Hayati. 41 for cytotoxic compounds for marine bacteria. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine MicroorganismV L WebbA Y KilimnikD A HulstonS HopfS HinkleyS ReaderA ThomsonWebb, V. L., Kilimnik, A. Y., Hulston. D. A., Hopf. S., Hinkley. S., Reader, S. and Thomson, A. 2006. Screening for cytotoxic compounds for marine bacteria. Conference From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. June 21-24, 2006. Greifswald, Germany.
Sentuhanteknologi DNA rekombinan pada florikultur antara lain dilakukan dengan mengisolasi dan memanipulasi gen biru dan gen etilen biru sesuai dengan tujuan yang dikehendaki. Di Amerika Serikat dan Eropa bibit violet carnation akan diproduksi melalui teknik rekayasa genetika. Bibit violet carnation transgenik ini disebut dengan moonshadow.
Artikel ini menyajikan latihan soal PTS Penilaian Tengah Semester beserta pembahasan soal untuk kelas 9 SMP di semester genap tahun 2021. Semoga bermanfaat dan bisa menjadi bahan belajar kamu ya. — Matematika Topik Bangun Ruang Sisi Lengkung Subtopik Jaring-jaring, Luas Permukaan dan Volume Bangun Ruang Sisi Lengkung Level MOTS 1. Jika satuannya diabaikan, perbandingan luas permukaan dan volume tabung adalah 4 5. Jika panjang jari-jari alas sama dengan tinggi tabungnya, maka volumenya adalah …. Jawaban A Pembahasan Diketahui bahwa panjang jari-jari alas sama dengan panjang tingginya, maka r = t. Perhatikan perhitungan berikut! Jadi, panjang jari-jari alas dan tinggi tabung adalah 5. Kemudian, perhatikan perhitungan berikut! Jadi, volume tabung tersebut adalah Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah A. Topik Bangun Ruang Sisi Lengkung Subtopik Jaring-jaring, Luas Permukaan dan Volume Bangun Ruang Sisi Lengkung Level HOTS 2. Gambar di bawah ini adalah sebuah kolam renang berbentuk lingkaran terbuat dari batu bata. Setiap meter persegi memerlukan 100 batu bata. Banyak batu bata yang diperlukan untuk membuat dinding kolam seluruhnya adalah …. A. 960 batu bataB. 544 batu bataC. 920 batu bataD. 316 batu bata Jawaban A Pembahasan Luas dinding kolam pada kolam renang di atas sama dengan luas selimut pada tabung. Setiap meter persegi memerlukan 100 batu bata, sehingga banyaknya batu bata yang diperlukan adalah buah batu bata. Jadi, jawaban yang tepat adalah A. Topik Bangun Ruang Sisi Lengkung Subtopik Perubahan Volume dan Kesebangun Bangun Ruang Level MOTS 3. Sebuah kerucut memiliki jari-jari r dan tinggi t. Jika jari-jarinya diperbesar dua kali dan tingginya diperbesar kali, perbandingan volume awal dan akhir kerucut adalah …. 1 2 1 3 1 5 1 6 Jawaban D Pembahasan Dari soal diketahui bahwa dan Perhatikan perhitungan berikut! Dengan demikian, perbandingan volume awal dan akhir kerucut adalah 1 6. Jadi, jawaban yang tepat adalah D. Topik Bangun Ruang Sisi Lengkung Subtopik Level 4. Perhatikan gambar dibawah! Dua buah bola dapat dimasukkan ke dalam sebuah balok dengan tepat. Perbandingan volume dua bola terhadap volume balok adalah …. Jawaban E Pembahasan Dari soal diketahui bahwa, dan Perhatikan perhitungan berikut! Jadi, jawaban yang tepat adalah D. Topik Bangun Ruang Sisi Lengkung Subtopik Aplikasi dan Latihan Soal Bangun Ruang Sisi Lengkung Level HOTS 5. Sebuah kap lampu berbentuk potongan kerucut seperti gambar berikut. Luas permukaan kap lampu tersebut adalah …. Jawaban A Pembahasan Perhatikan sketsa berikut! Dengan perbandingan segitiga sebangun, diperoleh hasil perhitungan sebagai berikut. Jadi, garis pelukis kerucut kecil adalah 5 cm. Akibatnya, garis pelukis kerucut besar adalah 5 + 20 = 25 cm. Dari sketsa di atas, diperoleh bahwa jari-jari kerucut besar 15 cm dan jari-jari kerucut kecil 3 cm. Oleh karena itu, diperoleh hasil perhitungan sebagai berikut. Dengan demikian, luas permukaan kap lampu tersebut adalah cm2 . Jadi, jawaban yang tepat adalah A. Bahasa Indonesia Topik Teks Tanggapan Subtopik Mengenal Teks Tanggapan Perhatikan kalimat berikut! Namun, menurut saya, guratan warna pada lukisan tersebut masih kurang tepat karena kurang menonjolkan unsur abstrak. Kalimat di atas memuat unsur tanggapan …. penolakan kritik sanggahan saran Jawaban CPembahasan Kalimat di atas memuat unsur tanggapan sanggahan. Sanggahan merupakan pernyataan yang sifatnya menyanggah atas sesuatu hal yang tidak disetujui. Kalimat sanggahan ditandai dengan kata-kata, seperti belum sesuai, kurang tepat, dan sebagainya. Kalimat di atas memuat frasa kurang tepat yang menandakan kalimat tersebut memuat tanggapan sanggahan. Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah C. Topik Teks Tanggapan Subtopik Kebahasaan Teks Tanggapan Kalimat yang memuat kata rujukan berupa kata tunjuk adalah … Kebijakan baru mulai diterapkan di berbagai sekolah-sekolah. Pemerintah dan masyarakat harus bekerja sama dalam menangani pandemi Covid-19. Masyarakat diimbau agar selalu menjalankan protokol kesehatan. Pandemi ini merupakan masalah yang harus diselesaikan secara bersama-sama. Jawaban DPembahasan Kata rujukan adalah kata yang menunjuk pada kata lain yang telah digunakan sebelumnya sebagai pengganti dari kata tersebut. Kata rujukan berupa kata tunjuk, yaitu kata ini, itu, tersebut. Kata rujukan terdapat pada kalimat Pandemi ini merupakan masalah yang harus diselesaikan secara bersama-sama, yaitu pada kata ini. Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah pilihan D. Topik Teks DiskusiSubtopik Mengenal Teks Diskusi, Kebahasaan Teks Diskusi Perhatikan kedua kutipan teks di bawah ini! Teks 1 Namun, harapan tinggallah harapan. Sudah sekian tahun berlalu, sejak reformasi bergulir pada tahun 1998, harapan itu belum juga menjadi kenyataan. Ketidakadilan bahkan semakin mewabah di berbagai lini kehidupan. Korupsi tetap mewabah di mana-mana. Rakyat kian menderita. Dibuai janji-janji manis alam demokrasi, seolah-olah rakyat punya kuasa. Padahal, semuanya semu. Teks 2 Jadi, dengan ketiadaan polisi tidur, perjalanan menjadi nyaman tanpa ada rasa terganggu. Tidak ada pula kekesalan dan sumpah dari mulut-mulut mereka. Namun, mereka tetap berhati-hati karena kehadiran rambu-rambu lalu lintas yang ada di sana. Keselamatan untuk semua pihak juga lebih terjamin. Perbedaan kedua kutipan teks di atas adalah … Teks 1 mengandung banyak fakta, sedangkan teks 2 sarat dengan argumen. Teks 1 merupakan bagian dari pengantar, sedangkan teks 2 merupakan kesimpulan. Teks 1 berkenaan dengan masalah politik, sedangkan teks 2 berkenaan dengan masalah kriminal. Teks 1 menyatakan bagian dari suatu argumen, sedangkan teks 2 termasuk dalam bagian kesimpulan. Jawaban DPembahasanPerbedaan kedua kutipan teks di atas adalah teks 1 menyatakan bagian dari suatu argumen, sedangkan teks 2 termasuk dalam bagian kesimpulan. Teks 1 menyatakan bagian dari suatu argumen, yaitu argumen tentang keadaan Indonesia setelah masa reformasi. Sementara itu, teks 2 merupakan kesimpulan, yaitu keberadaan polisi tidur. Pilihan A tidak tepat karena kedua teks berisi argumen. Pilihan B tidak tepat karena teks 1 tidak berisi pengantar/pendahuluan sebuah topik dan teks 2 memang berisi sebuah kesimpulan. Pilihan C tidak tepat karena teks 1 tidak spesifik membahas politik dan teks 2 juga tidak membahas mengenai masalah kriminal. Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah pilihan D. Topik Teks DiskusiSubtopik Kebahasaan Teks Diskusi Perhatikan kutipan teks di bawah ini! Memiliki kendaraan pribadi tentu membuat para pengendara tidak lagi kesulitan untuk melakukan rute perjalanan yang diinginkan. Lain halnya jika kita menggunakan kendaraan umum, seperti bus atau kereta api yang mengharuskan melalui rute perjalanan yang telah ditentukan. Kata teknis yang berkaitan dengan isu utama pada kutipan di atas adalah …. bus rute kendaraan kereta api Jawaban CPembahasan Kata teknis adalah kata khusus yang digunakan dalam bidang tertentu. Kutipan di atas membahas isu tentang moda transportasi, yaitu transportasi umum dan transportasi pribadi. Kata teknis pada kutipan di atas adalah kendaraan. Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah pilihan C. Topik Teks DiskusiSubtopik Menganalisis Teks Diskusi, Kebahasaan Teks Diskusi Perhatikan kutipan teks di bawah ini! Rasa memiliki warga Bandung terhadap kotanya itulah yang harus tumbuh pada diri masyarakat lainnya. Perasaan bahwa Bandung itu milik bersama harus benar-benar hidup pada diri setiap warganya. Warga Bandung tidak sekadar warga yang tinggal di Bandung, tetapi orang yang memiliki kecintaan dan tanggung jawab terhadap tempat tinggalnya. Isu yang diungkapkan dalam kutipan di atas adalah …. keadaan warga suatu kota kehidupan masyarakat perkotaan kesadaran warga terhadap kotanya kebiasaan yang dapat dicontoh dari warga suatu kota Jawaban CPembahasan Isu yang diungkapkan dalam kutipan di atas adalah kesadaran warga terhadap kotanya. Kesadaran tersebut adalah rasa memiliki warga terhadap kotanya. Apabila seorang warga memiliki rasa memiliki terhadap kotanya, akan tumbuh kecintaan dan tanggung jawab merawat dan menjaga kota tersebut. Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah pilihan C. Biologi Topik Bioteknologi Subtopik Bioteknologi Modern Level Medium Seorang peneliti melakukan penelitian menggunakan teknologi DNA rekombinan. Pada penelitian ini, ia menggunakan vektor berupa plasmid bakteri. Alasan peneliti tersebut menggunakan plasmid bakteri adalah …. berukuran besar sehingga mudah untuk disisipkan DNA mudah disisipkan dan sulit dikeluarkan dari tubuh inang tidak mampu bereplikasi secara cepat sifatnya dapat diturunkan dari sel induk ke keturunannya Jawaban D Pembahasan Plasmid bakteri merupakan rangkaian DNA non-kromosom, atau DNA yang tidak menyusun kromosom, yang berbentuk sirkuler atau melingkar dan terdapat pada sitoplasma sel bakteri. Sifat plasmid bakteri yaitu berukuran sangat kecil, dapat bereplikasi, mudah disisipkan dan dikeluarkan dari tubuh inang, dan sifatnya dapat diturunkan dari sel induk ke keturunannya. Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah D. Topik Bioteknologi Subtopik Prinsip Dasar Bioteknologi Level Easy Cabang ilmu yang mempelajari tentang pemanfaatan proses biologi untuk menghasilkan barang dan jasa dengan rekayasa fermentasi, biokimia dan genetika adalah …. bioteknologi fermentasi kloning fusi sel Jawaban A Pembahasan Bioteknologi berasal dari kata bios hidup, teknos penerapan dan logos ilmu jadi bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari tentang pemanfaatan proses biologi untuk menghasilkan barang dan jasa dengan rekayasa fermentasi, biokimia dan genetika. Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah A. Topik Bioteknologi Subtopik Peranan Bioteknologi Dalam Berbagai Bidang Level HOTS Tomat flavr savr merupakan salah satu jenis tomat hasil dari proses rekayasa genetika. Tomat ini tahan busuk dan telah memberikan kontribusi yang besar di bidang pertanian. Buah tomat ini direkayasa dengan cara menyisipkan gen sehingga buah tomat tersebut tidak cepat membusuk. Selain dampak positif dari hasil bioteknologi tersebut ternyata penggunaan produk ini dikhawatirkan juga menimbulkan dampak negatif bagi kesehatan manusia yaitu …. dapat menyebabkan timbulnya kanker melemahnya sistem kekebalan tubuh menimbulkan gejala alergi pada tubuh menyebabkan terbentuknya antibodi baru pada tubuh Jawaban C Pembahasan Tomat flavr savr memberikan dampak besar dalam bidang perkebunan karena sifatnya yang tahan busuk. Jenis tomat ini jika dikonsumsi dalam jangka waktu yang lama dapat menyebabkan keluhan penyakit seperti alergi, gatal-gatal, ruam pada permukaan kulit dan kulit bersisik. Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah C. Topik Bioteknologi Subtopik Bioteknologi Konvensional Level Medium Perhatikan pernyataan berikut! Pembuatan alkohol dengan pemanfaatan Saccharomyces sp. Pembuatan nata de coco dengan pemanfaatan Acetobacter xylinum Proses ekstraksi logam dengan pemanfaatan Thiobacillus ferrooxidans Pembuatan hormon pertumbuhan dengan pemanfaatan Escherichia coli Pernyataan tersebut merupakan penerapan prinsip bioteknologi. Produksi yang menerapkan bioteknologi konvensional ditunjukkan oleh nomor …. 1 dan 4 1 dan 2 3 dan 4 2 dan 4 Jawaban B Pembahasan Bioteknologi konvensional sering disebut juga dengan bioteknologi tradisional. Bioteknologi konvensional adalah suatu penerapan bioteknologi dengan menggunakan cara-cara dan peralatan yang sederhana. Kegiatan bioteknologi konvensional biasanya hanya memanfaatkan organisme dalam proses fermentasi. Contoh bioteknologi konvensional adalah Pembuatan alkohol dengan pemanfaatan Saccharomyces sp. Pembuatan nata de coco dengan pemanfaatan Acetobacter xylinum Pembuatan tempe dengan pemanfaatan Rhizopus oligosporus Pembuatan tauco dengan pemanfaatan Aspergillus oryzae Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah B. Topik Bioteknologi Subtopik Bioteknologi Modern Level HOTS Daniel sedang melakukan eksplorasi di sebuah hutan pedalaman Sumatera. Dalam perjalanannya dia menemukan sebuah spesies tumbuhan langka dan sudah termasuk kedalam kategori tumbuhan yang terancam punah. Daniel berencana ingin melestarikan jenis tumbuhan tersebut. Cara yang tepat untuk mengembangbiakan jenis tumbuhan tersebut adalah …. melakukan kultur in vivo pada putik dan benang sari tumbuhan tersebut memanfaatkan sifat totipotensi yang dimiliki oleh tumbuhan tersebut menggabungkan gen dari tumbuhan tersebut dengan gen dari jenis tumbuhan yang lain mengubah susunan gen dari tumbuhan tersebut sehingga tumbuhan tersebut tahan terhadap hama Jawaban B Pembahasan Hal yang tepat dilakukan untuk mengembangbiakan tumbuhan langka adalah dengan cara kultur jaringan. Kultur jaringan adalah salah satu cara perbanyakan tumbuhan secara vegetatif berdasarkan sifat totipotensi yang dimilikinya. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel tumbuhan untuk tumbuh menjadi individu baru yang sempurna. Kultur jaringan dilakukan dengan cara mengisolasi sel atau jaringan dari tanaman seperti bagian jaringan meristem dan menumbuhkannya pada media tumbuh yang kaya nutrisi dengan kondisi aseptik sehingga bagian tanaman tersebut tumbuh menjadi tanaman lengkap. Hasil tanaman kultur jaringan akan memiliki sifat yang sama dengan induk, dapat menghasilkan keturunan dalam jumlah yang banyak dan seragam serta dapat mempercepat waktu pertumbuhan. Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah B. Topik Tanah dan Kehidupan Subtopik Bagian-Bagian Tanah Level Medium Perhatikan karakteristik tanah di bawah ini! Memiliki ukuran partikel yang kecil Memiliki ukuran partikel yang besar Mudah ditembus air Sulit ditembus air Mampu menahan air Tidak bisa menahan air dalam waktu yang lama Karakteristik tanah pasir ditunjukkan oleh nomor …. 2, 3, dan 6 1, 4, dan 5 1, 4, dan 6 2, 3, dan 5 Jawaban A Pembahasan Tanah pasir memiliki karakteristik ukuran partikelnya besar, berpori, mudah ditembus air, dan tidak bisa menahan air dalam waktu yang lama. Sementara itu, karakteristik tanah yang memiliki ukuran partikel kecil, sulit ditembus air dan mampu menahan air adalah tanah lempung. Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah A. Bahasa Inggris Topik Conjunction Subtopik Coordinating Conjunction Level Easy 1. Adam Excuse me, can I borrow this book without my ID Card? Librarian I am afraid you can’t. We need the ID Card, ____ we can register your name. The correct answer to complete the dialogue is …. for or so yet Jawaban C Pembahasan Konjungsi yang tepat adalah so yang artinya “sehingga”. Konjungsi tersebut akan membuat kalimatnya berbunyi “Kami membutuhkan kartu identitas Anda sehingga kami dapat mendata nama Anda.”. Kata for artinya “karena”, or artinya “atau”, dan yet artinya “tetapi”. Jadi, pilihan jawaban yang tepat adalah C. Topik Conjunction Subtopik Subordinating Conjunction Level Medium 2. Suho is present today ____ he is feeling unwell. The correct conjunction to fill in the blank is …. since because even though whereas Jawaban C Pembahasan Arti dari kalimat tersebut adalah “Suho hadir pada hari ini ____ dia merasa tidak sehat”. Kalimat tersebut menyatakan situasi “bertentangan”, maka harus dihubungkan dengan konjungsi yang bermakna “meskipun” even though. Jadi, pilihan jawaban yang tepat adalah C. Read the text carefully to answer the question number 3-5! Long ago, there was an old and poor couple living in a village in Japan. They always seemed to be so sad because they had a wish which was difficult to be true. The wish was not about wealth or prosperity. It was about having a child. One day, the old woman went to a river and washed clothes there. While washing, she did not forget to wish for having a child. Suddenly, she saw a giant peach floating down the river. Without thinking, she just took it home and planned to cut it with her husband. However, when arriving at home, she could not cut the peach because she heard a human voice shouting not to cut it. Surprisingly, a baby boy jumped out of that peach. At first, the couple could not believe that he was a human. Then, they tried to be closer and ensured themselves that he was a real human. They became excited to have a baby who was then called as “Momotaro”, which meant Peach Boy. After 15 years later, the village was disturbed by Oni Monsters who always stole the villagers’ belongings. Momotaro knew it and had a strong will to help all villagers. He informed his parents that he wanted to fight Oni Monsters, so the villagers would not be afraid of them anymore. Knowing his bravery, his father prepared him with a sword, and his mother gave him a bag of dumplings. On the way, Momotaro met a dog, a monkey, and a hawk. He shared the dumplings with them in order to ask for help. Luckily, they agreed to join and fight Oni Monsters with Momotaro. Being a good leader, he could manage his team to have great teamwork. Finally, the leader of Oni Monsters gave up and let him take the treasure. After that, Momotaro along with his team shared it with all people in the village. His parents were very proud of him. Topik Narrative Text Subtopik Kinds of Narrative Text Level Medium 3. The reason why the couple decided not to cut the peach is … There was a strange voice coming from the peach. The old woman did not want to do that. The peach asked them to wait. Oni Monsters prohibited them to do it. Jawaban A Pembahasan Pada paragraf kedua, terdapat kalimat “However, when arriving at home, she could not cut the peach because she heard a human voice shouting not to cut it.”. Jadi, alasan yang tepat adalah “There was a strange voice coming from the peach.”. Dengan demikian, pilihan jawaban yang tepat adalah A. Topik Narrative Text Subtopik Introduction to Narrative Text Level Medium 4. “Being a good leader, he could manage his team to have great teamwork.” The word “he” in the sentence refers to …. The leader of Oni Monsters Oni Monsters Momotaro the villager Jawaban C Pembahasan Untuk mencari sebuah reference, perhatikan kalimat yang muncul sebelum kalimat tersebut. “Luckily, they agreed to join and fight Oni Monsters with Momotaro. Being a good leader, he could manage his team to have a great teamwork.” “Untungnya, mereka setuju untuk bergabung dan melawan Oni Monsters bersama Momotaro. Menjadi seorang pemimpin yang baik, dia dapat mengatur timnya memiliki kerjasama yang baik”. Dapat disimpulkan bahwa “he” yang memimpin perlawanan pada Oni Monsters adalah Momotaro. Jadi, jawaban yang tepat adalah C. Topik Narrative Text Subtopik Introduction to Narrative Text Level HOTS 5. What can we learn from the text? Don’t be angry with parents! Run away from a conflict! Let’s fight a stranger! Be brave for a noble purpose! Jawaban D Pembahasan Teks tersebut menceritakan betapa beraninya Momotaro bertarung karena dia ingin membantu semua orang yang ada di desa terbebas dari Oni Monsters. Berarti, pesan yang dapat kita dapatkan adalah Be brave for a noble purpose! “Jadilah berani untuk sebuah tujuan mulia!”. Jadi, pilihan jawaban yang tepat adalah D. Ekonomi Topik Ketergantungan Antar Ruang dilihat dari Konsep Ekonomi NEW! Subtopik Perdagangan Internasional 1. Jika kita akan menukarkan uang dollar di bank untuk mendapatkan rupiah, kurs yang berlaku adalah …. kurs jual kurs beli kurs stabil kurs tengah JawabanBPembahasan Kurs beli adalah nilai tukar yang ditawarkan oleh pihak pembeli atau pedagang valuta asing. Karena posisi kita sebagai penjual, sedangkan bank sebagai pembeli maka yang berlaku kurs beli. Dengan kata lain, bank membeli valuta asing dari masyarakat. Dengan demikian, jawaban yang tepat adalah B. Topik Ketergantungan Antar Ruang dilihat dari Konsep Ekonomi NEW! Subtopik Pengembangan Pusat-pusat Keunggulan Ekonomi untuk Kesejahteraan Masyarakat 2. Perhatikan gambar berikut ini! Dikutip dari pada 3 Februari 2021 Gambar tersebut merupakan keunggulan ekonomi berasal dari daerah …. Maluku Nusa Tenggara Timur Nusa tenggara Barat Bali Jawaban BPembahasan Salah satu pusat keunggulan ekonomi di wilayah Indonesia, yaitu pulau komodo. Pulau Komodo adalah sebuah pulau yang terletak di Kepulauan Nusa Tenggara, berada di sebelah timur Pulau Sumbawa, yang dipisahkan oleh Selat Sape. Pulau Komodo dikenal sebagai habitat asli hewan komodo. Pulau ini termasuk salah satu kawasan Taman Nasional Komodo yang dikelola oleh pemerintah pusat. Jadi, jawaban yang tepat adalah B. Topik Ketergantungan Antar Ruang dilihat dari Konsep Ekonomi NEW! Subtopik Pasar Bebas 3. AFTA adalah kesepakatan dari negara-negara ASEAN untuk membentuk kawasan perdagangan bebas guna meningkatkan daya saing ekonomi di kawasan ASEAN. AFTA dibentuk pada tahun 1992 di Konferensi Tingkat Tinggi KTT ASEAN ke IV di Singapura. Berikut ini yang merupakan tujuan dari AFTA adalah …. menghambat perdagangan antar negara anggota ASEAN menjadikan negara ASEAN menjadi saling berkompetisi untuk memonopoli perdagangan dunia menjadikan kawasan ASEAN sebagai tempat produksi yang kompetitif sehingga ASEAN memiliki daya saing menjalin perdagangan bebas antara negara-negara ASEAN dengan Tiongkok Jawaban CPembahasan Tujuan didirikannya AFTA ASEAN Free Trade Area adalah Menjadikan kawasan ASEAN sebagai tempat produksi yang kompetitif sehingga ASEAN memiliki daya saing tinggi di tingkat global, Meningkatkan perdagangan antar negara anggota ASEAN, dan Meningkatkan keterkaitan investasi dari negeri dalam bentuk foreign direct investment. Jadi, jawaban yang tepat adalah C. Topik Ketergantungan Antar Ruang dilihat dari Konsep Ekonomi NEW! Subtopik Mengembangkan Ekonomi Kreatif Berdasarkan Potensi Wilayah 4. Perhatikan pernyataan berikut ini! Membuat roadmap industri kreatif. Menyiapkan insentif untuk memacu pertumbuhan industri kreatif. Mengembangkan sistem informasi. Meningkatkan penggunaan teknologi melalui program kemitraan. Melakukan penciptaan identitas nasional dan lokal. Berdasarkan pernyataan tersebut, yang merupakan upaya kementerian perdagangan dalam mengembangkan ekonomi kreatif ditunjukkan oleh nomor …. 1, 2, dan 3 1, 3, dan 5 2, 3, dan 4 3, 4, dan 5 Jawaban DPembahasan Upaya kementerian perdagangan dalam mengembangkan ekonomi kreatif, yaitu Mengembangkan sistem informasi, 3 Meningkatkan penggunaan teknologi melalui program kemitraan, 4 Melakukan penciptaan identitas nasional dan lokal, 5 Mengadakan pekan produk kreatif Indonesia atau PPKI, Meningkatkan jangkauan dan efektivitas pemasaran, dan Melakukan penciptaan identitas nasional dan lokal. Jadi, jawaban yang tepat adalah D. Topik Ketergantungan Antar Ruang dilihat dari Konsep Ekonomi NEW! Subtopik Pengembangan Pusat-pusat Keunggulan Ekonomi untuk Kesejahteraan Masyarakat 5. Ditemukannya tambang emas ilegal di daerah Bogor menyebabkan berbagai dampak lingkungan yang besar karena pengolahannya yang tidak resmi dan tidak diawasi pemerintah. Melihat kejadian dan potensi yang dimiliki di daerah Bogor ini pemerintah mengambil alih untuk mengendalikan kegiatan tambang agar pengolahannya aman dan penyaluran tepat sasaran serta menjadikan kota Bogor menjadi salah satu penghasil emas di Indonesia. Kejadian ini merupakan contoh dari …. perdagangan internasional perdagangan bebas sistem ekonomi terpusat pusat keunggulan ekonomi Jawaban DPembahasan Pusat keunggulan ekonomi adalah suatu sistem ekonomi dimana pemerintah ikut andil dan berpengaruh dalam mengendalikan kegiatan perekonomian dalam suatu daerah. Kejadian di atas menggambarkan bahwa tambang emas ilegal di Bogor diambil alih oleh pemerintah sehingga semua kegiatan tambang dapat diawasi oleh pemerintah agar pengolahannya aman dan penyaluran tepat sasaran. Jadi, jawaban yang tepat adalah poin D. Nah, itu tadi latihan soal untuk PTS kelas 9 SMP di semester genap tahun 2021 ini. Gimana? Kalau kamu merasa masih butuh banyak latihan soal lagi, gabung di ruangbelajar Plus yuk. Ada ribuan soal yang bisa kamu dapatkan di bank soal plus fitur lengkap lainnya. Daftar sekarang juga ya.
BbAeoge. 49xtvjz1bs.pages.dev/27949xtvjz1bs.pages.dev/32549xtvjz1bs.pages.dev/7449xtvjz1bs.pages.dev/15849xtvjz1bs.pages.dev/32749xtvjz1bs.pages.dev/42149xtvjz1bs.pages.dev/1549xtvjz1bs.pages.dev/74
seorang peneliti melakukan penelitian menggunakan teknologi dna rekombinan
